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2021 Volume 43 Issue 12
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LAN Caiyun, SONG Hongyuan. Effect of DWF4 Gene Overexpression on Growth and Development in Brassica juncea[J]. Journal of Southwest University Natural Science Edition, 2021, 43(12): 26-37. doi: 10.13718/j.cnki.xdzk.2021.12.004
Citation: LAN Caiyun, SONG Hongyuan. Effect of DWF4 Gene Overexpression on Growth and Development in Brassica juncea[J]. Journal of Southwest University Natural Science Edition, 2021, 43(12): 26-37. doi: 10.13718/j.cnki.xdzk.2021.12.004
shu

Effect of DWF4 Gene Overexpression on Growth and Development in Brassica juncea

  • 1.

    Modern Agricultural Park Development Center of Jiangjin District Chongqing City, Jiangjin Chongqing 402260, China

  • 2.

    School of Horticulture and Landscape Architecture, Southwest University, Chongqing 400715, China

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  • Corresponding author: SONG Hongyuan
  • Received Date: 18/04/2020
    Available Online: 20/12/2021

  • MSC: S188; Q786

  • In order to understand the role and function of DWF4 gene in the growth process of mustard (Brassica juncea Coss.) and to lay a theoretical foundation for the development of biotechnology to regulate plant growth and development in the future, DWF4 gene was introduced into mustard by means of Agrobacterium-mediated transformation. Compared with the control, i.e. the wild type, the plants of pCABarDWF4 transgenic mustard grewmorerapidly and vigorously, with larger leaf, flower and other organs, had significantly greater plant height, plant expansion, maximum leaf width and maximum leaf length and longer podding branches, more branches, more pods, higher seed rate and more seeds, and their bolting time and flowering time were advanced. Quantitative PCR analysis of pCABarDWF4 transgenic mustard plants showed that DWF4 gene enhanced the expression of the genes related to endogenous BR synthesis pathways in the plant. In conclusion, the DWF4 gene promotes the endogenous BR synthesis in mustard and thus favors the growth and development of the plant.
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通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com
  • 1. 

    沈阳化工大学材料科学与工程学院 沈阳 110142

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Effect of DWF4 Gene Overexpression on Growth and Development in Brassica juncea

    Corresponding author: SONG Hongyuan
  • Received Date: 18/04/2020
  • Available Online: 20/12/2021

Abstract: In order to understand the role and function of DWF4 gene in the growth process of mustard (Brassica juncea Coss.) and to lay a theoretical foundation for the development of biotechnology to regulate plant growth and development in the future, DWF4 gene was introduced into mustard by means of Agrobacterium-mediated transformation. Compared with the control, i.e. the wild type, the plants of pCABarDWF4 transgenic mustard grewmorerapidly and vigorously, with larger leaf, flower and other organs, had significantly greater plant height, plant expansion, maximum leaf width and maximum leaf length and longer podding branches, more branches, more pods, higher seed rate and more seeds, and their bolting time and flowering time were advanced. Quantitative PCR analysis of pCABarDWF4 transgenic mustard plants showed that DWF4 gene enhanced the expression of the genes related to endogenous BR synthesis pathways in the plant. In conclusion, the DWF4 gene promotes the endogenous BR synthesis in mustard and thus favors the growth and development of the plant.

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  • BR缺陷突变体如拟南芥中的DET2，DWARF4(DWF4)和CPD，番茄中的DWARF，豆科植物中的LKB；BR不敏感突变体如拟南芥中的DWF12，BRI1，BIN2，BAK1，豆科植物中的LKA，番茄中的CURL-3等都不同程度表现为根长、株高、花序、角果、叶柄、胚轴的减短、顶端优势的减弱、育性衰减、开花和叶片卷曲、维管束和光形态建成上的变化，显示BR在植株生长和发育中的重要作用[1]. 通过在植株中超表达DWF4基因，可以使植株更高，叶片更多[2]. 目前还发现BR和其他激素在侧根发生方面起到的协同作用[3]，然而对于下胚轴和根的向地性方面起到的却是反作用. 低浓度水平下的BR促进根的伸长，高浓度则抑制根的伸长[3]. 多种实验结果证明BR能促进产量提高. 水稻BR缺陷突变体BRD2致使谷物颗粒变短而且缩小，而DWF11突变体也呈现出种子减少现象[4]. 相反，超表达BR生物合成基因将增大水稻颗粒，增加水稻产量，转基因水稻与野生型相比，分蘖数更多[5]. 在拟南芥中，BR对种子发育有决定性作用，包括种子大小、种子形状和种子数量等[6]. 拟南芥BR缺陷突变体DWF5结出的种子变小[7]，BR缺陷突变体DET2和BRI1-5的种子也都比野生型小，而且DET2和BRI1-5的种子质量比野生型分别轻17%和10%，BZR1功能获得型突变体BZR1-1D的种子与野生型相比，不仅更小而且变得更轻[6]. 在拟南芥中，超表达DWF4可以提高种子数量. 就如Choe等[2]研究过表达BR合成关键基因，获得了转基因拟南芥植株，对该转基因植株的果荚和分枝数统计调查显示其数量均增加2倍，种子产量增加了59%，GC-MS分析表明该转基因植株內源BR水平确实有所升高. 另外，BR还调节植物花期和衰老. BR相关基因CPD，可以通过光周期途径调节开花，而CPD同系物GmCPDs促成开花发育，调控花期[8]. 水稻BR信号途径相关基因SDG725，也和花期调控相关[9].

    目前，在BR的生物合成、代谢作用、信号转导途径中都有很多报道，其中DWF4编码细胞色素P450酶，与CPD基因处于同一家族不同亚族[10]. DWF4的mRNA水平因外源施加油菜素内酯(brassinolide，BL)而大幅下降，因施加BRZ(油菜素内酯抑制剂)而大幅提高，证实DWF4在BR平衡调节上起到了重要的作用[11]. DWF4敲除突变体的内源BRs缺失将致使植株矮小，突变体植株细胞伸长受到限制[12]. 对野生型植株施加BRZ，将抑制或结合DWF4酶[13]，也会造成内源BRs缺失致使植株矮小. DWF4是维持BR平衡的关键基因，因其可以迅速而准确地对内源BR水平响应表达变化[14]. 本实验中通过农杆菌介导转化法将DWF4基因导入芥菜中，研究DWF4基因在芥菜生长过程中的作用与功能，为解析DWF4基因参与BR信号传导的机制提供直接或者间接的实验证据，也为今后开发生物技术手段调控植物生长发育奠定理论基础.

1.   材料与方法

    1.1.   材料

  • 含pCABarDWF4植物表达载体质粒的农杆菌由西南大学蔬菜学实验室提供，表达载体结构示意图见图 1.

    • 1.2.   芥菜遗传转化

  • 利用农杆菌介导法转化芥菜，芥菜种子所需消毒时间为75%的乙醇消毒1 min，0.1%的升汞处理8 min，所需农杆菌侵染时间为8 min，使用的预培养基成分为MS+2 mg/L 6-BA(6-苄基腺嘌呤)+0.2 mg/L NAA(萘乙酸)；筛选培养基成分为MS+2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+8 mg/L PPT(膦丝菌素)+400 mg/L Carb(羧苄青霉素)；生根培养基成分为MS+0.2 mg/L NAA+8 mg/L PPT+400 mg/L Carb.

    • 1.3.   转基因芥菜植株的PCR鉴定

  • 采用CTAB法提取获得的转基因芥菜植株基因组DNA进行PCR扩增. 引物DWF4-1和DWF4-2用于pCABarDWF4转基因芥菜植株DWF4基因片段的检测. PCR扩增参数：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 40 s；56 ℃ 40 s；72 ℃延伸2 min；30个循环；72 ℃延伸10 min. 获得的扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测.

    • 1.4.   pCABarDWF4转基因芥菜植株DWF4基因、BR生物合成结构基因、转录调控基因的表达分析

  • 用TIANGEN RNA prep pure Plant Kit提取试剂盒提取pCABarDWF4转基因芥菜植株总RNA，根据TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix(TaKaRa)试剂盒说明书进行cDNA合成，获得的第一链cDNA稀释5倍后作为RT-PCR模板. 以芥菜BjActin为内参，对转基因植株和非转基因植株中的DWF4基因BR生物合成结构基因的表达情况进行Real Time RT-PCR分析，反应在C1000/CFX96仪器(Bio-Rad，美国)上完成，具体操作按照SYBR© Premix Ex TaqTM Ⅱ说明书进行. 利用Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪CFX Manager Software软件(2-ΔΔCT法)和Microsoft Excel软件分析数据.

    • 1.5.   pCABarDWF4转基因芥菜植株形态分析

  • pCABarDWF4转基因芥菜植株及非转基因植株种子播种于培养皿中，铺上滤纸，只施加蒸馏水，置于25 ℃培养室中，光照条件和黑暗条件下培养4 d，每个基因型进行3次重复，每个重复20粒种子，最后调查其根长、下胚轴长、总长，在滤纸上吸干水后测其鲜质量，最后置于60 ℃烘箱中烘干测其干质量. pCABarDWF4转基因芥菜植株及非转基因植株播种于培养盆中，播种后每隔15 d测量其株高、开展度、单株最大叶长和最大叶宽，自花授粉结束后测量主枝长度、主枝果荚数、主枝种子数、一次分枝数、一次分枝果荚数、一次分枝种子数、二次分枝数、二次分枝果荚数、二次分枝种子数并测量千粒质量和籽粒密度. 千粒质量的测定：转基因植株和野生型植株种子分别取100粒称质量，3次重复，取其平均值. 籽粒密度(D)的测定：取200粒称质量记为M，然后将籽粒放入事先盛有定量体积V1酒精的量筒中，然后读取体积V2，则籽粒体积V=V2-V1. 籽粒密度D=M/V，单位g/mL，3次重复.

2.   结果与分析

    2.1.   pCABarDWF4转基因芥菜植株的获得及鉴定

  • PCABarDWF4表达载体通过农杆菌介导的下胚轴转化，侵染后的下胚轴转接至含8 mg/L PPT和400 mg/L Carb的抑菌筛选培养基上，对获得的不定芽进行多代筛选，淘汰未转化的白化芽和嵌合体，获得多个具PPT抗性的绿色愈伤组织和芽(图 2a和图 2b)，抗性芽接种至生根培养基上进行生根培养(图 2c). 抗性植株炼苗后，移栽至泥炭土营养钵中(图 2d)，最后定植于大田中，正常管理至植株开花. 提取pCABarDWF4转基因芥菜植株T0代基因组DNA从3株转基因植株中扩增到预期大小300 bp左右的目的片段(图 2e).

    • 2.2.   pCABarDWF4转基因芥菜植株DWF4基因的表达分析

  • 提取pCABarDWF4转基因芥菜植株的RNA，以芥菜BjActin为内参进行DWF4基因的定量表达分析. 从结果(图 3)可以看出，pCABarDWF4转基因芥菜D1，D2和D3植株中，DWF4基因均有不同程度的表达，但表达量在植株之间有差异，D2和D3植株中目的基因表达量较高，对照野生型植株(WT)未检测到明显的DWF4表达.

    • 2.3.   pCABarDWF4转基因芥菜植株苗期光暗处理表现分析

  • 将pCABarDWF4转基因芥菜种子进行光照处理后调查其生长状况. 从表 1可以看出，D2和D3的根长显著高于野生型，D1的根长虽然高于野生型但未达到统计学意义. D1和D3的下胚轴长显著高于野生型. D1，D2和D3苗期总长均显著高于野生型. 在鲜质量方面，转基因植株以及野生型植株之间差异无统计学意义. 在干质量方面，D1和D3显著高于野生型，D2的干质量虽然高于野生型但差异无统计学意义. 相比之下，苗期生长最为旺盛的是D3. 综上所述，在光照条件下，在芥菜中超表达DWF4基因能一定程度上促进苗期生长.

    与光照条件下相比，在黑暗中，不管是转基因植株还是野生型植株，苗期下胚轴都大幅度伸长，但植株纤弱，子叶黄化. 从表 2中可以看出，D2和D3的根长显著高于野生型，D1的根长虽然高于野生型但差异无统计学意义. D1和D3苗期下胚轴长均显著高于野生型，D2下胚轴长低于野生型. 在苗期总长上，D1和D3显著高于野生型，由于D2下胚长较短的原因，所以其总长与野生型差异无统计学意义. 在鲜质量和干质量上，转基因植株与野生型植株之间差异无统计学意义. 从实验结果可以看出，在黑暗条件下，DWF4基因能在一定程度上促进苗期根和下胚轴伸长.

    光照条件与黑暗条件下不同的是，光照条件下苗期干质量差异有统计学意义. 不论是置于光照还是黑暗条件下，D3生长都是最为旺盛的，苗期总长和下胚轴长都显著高于野生型. 通过对转基因植株苗期光照和黑暗条件下生长情况的统计，可以发现转基因植株根和下胚轴长一定程度上都高于野生型植株，而且D3表现最好. 结合D3转基因株系DWF4基因较高的表达水平，显示DWF4基因表达较高者，其苗期根以及下胚轴生长速度会更快.

    • 2.4.   pCABarDWF4转基因芥菜植株生长情况分析

  • 将pCABarDWF4转基因芥菜植株置于人工气候室内培养观察，从其整个生命周期中，转基因植株比野生型植株生长更加旺盛. 在60 d时，转基因植株就已经比野生型植株长得更壮，其叶片伸展更开(图 4a).

    到180 d时，转基因植株开始逐渐抽薹，而野生型植株还没有抽薹(图 4c). 转基因植株最早开花时间比野生型植株提前一个多月. 转基因植株和野生型植株花器官相比，转基因植株的花瓣较大(图 4d). 对比转基因植株和野生型植株同时期的叶片，可以发现转基因植株叶片伸展更长、更宽，而且叶片颜色更加浓绿(图 4b). 从图 5中可以发现，随着时间的延长，转基因植株和野生型植株的株高、开展度、最大叶长和最大叶宽也随着增长，但是转基因植株生长明显快于野生型植株. 转基因植株之间相比，D2和D3生长势明显好于D1.

    • 2.5.   pCABarDWF4转基因芥菜植株结籽情况分析

  • 进一步对转基因植株结荚结籽情况进行了调查. 转基因植株枝条上比野生型植株结有更多的种子(图 6a)，转基因植株果荚长度高于野生型植株果荚长度(图 6b)，且转基因植株果荚结籽数更多(图 6c和图 6d).

    从表 3中可以看出，转基因植株主枝长度远远超过野生型植株. 除D3外，主枝平均果荚数也超过了野生型，转基因植株主枝果荚长度和所结种子数均高于野生型. 转基因植株一次分枝数和二次分枝数高于野生型，且一次分枝果荚数、一次分枝所结种子数和二次分枝果荚数、二次分枝所结种子数也都高于野生型. 综合来看，转基因植株种荚率、全株总种荚数和所结总种子数均高于野生型植株. 对千粒质量和籽粒密度测量数据来看，D1和D2超过野生型而D3与野生型基本一致. 结果显示，在芥菜中超表达DWF4基因具有明显增加种子产量的作用.

    • 2.6.   pCABarDWF4转基因芥菜植株BR生物合成结构基因

  • DET2，ROT3，CPD，CYP85A2等基因被认为参与了BR的生物合成. 在pCABarDWF4转基因植株中，DWF4下游基因DET2在D2和D3株系中平均表达量是野生型的2倍，说明超表达DWF4基因促进了下游DET2基因的表达(图 7a).

    DET2基因下游的ROT3基因在转基因植株中的平均表达量高出野生型植株的40%(图 7b).

    CPD基因代谢油菜甾醇(campesterol)和其他中间产物，而DWF4基因也参与代谢油菜甾醇，DWF4基因与CPD基因可能存在竞争作用. 在本实验中，pCABarDWF4转基因芥菜植株的CPD基因表达量都低于野生型，其平均表达量只达到野生型植株表达量的一半，说明DWF4基因与CPD基因表达呈负相关(图 7c).

    CYP85A2是BR生物合成途径中的重要因子，在pCABarDWF4转基因芥菜植株中，他们的相对表达量都不同程度高于野生型，CYP85A2是在BR合成途径中最后一步反应的基因，说明转基因pCABarDWF4芥菜中，超表达DWF4基因促进了下游相关BR合成基因的表达，促进了BR的生物合成.

    • 2.7.   pCABarDWF4转基因芥菜植株BR转录调控相关基因表达分析

  • BR生物合成除了结构基因的表达外，还受到细胞内其他转录激活或者转录抑制基因的调控.

    BAK1是一类重要的类受体蛋白，参与调控BR的合成，调节植物生长发育. 在pCABarDWF4转基因植株中，BAK1基因表达量均比野生型植株表达量升高，且平均值高出近40%(图 8a).

    BAS1基因表达被外源BR诱导，功能应该是维系内源BR的恒定水平，其羟化C26，影响植株体内BR量，是一个油菜素内酯失活基因. 在本研究中，虽然转基因植株中BAS1的平均表达量0.95高于野生型植株表达量0.83，但随着DWF4基因表达水平上升，BAS1基因表达水平降低(图 8b).

    BES1和BZR1是油菜素甾醇信号途径下游最重要的一类转录因子，参与油菜素甾醇合成转录的诱导和抑制调控. 在本研究中，转基因株系中BES1和BZR1的平均表达量分别是野生型植株的2~3倍(图 8c和图 8d)，说明超表达DWF4基因导致细胞内BR积累水平上升后，引起BES1和BZR1基因表达水平上升，促进细胞内积累更多的BR.

    BIN2在BR途径中起到调控BES1和BZR1的作用，在转基因植株中BIN2基因的平均表达量是野生型植株的2倍(图 8e)，BES1和BZR1表达量较高，那么BIN2表达量应和这两个基因表达量相一致.

    BSKs是一类参与油菜素内酯信号转导的植物特异受体类胞质激酶，参与BR信号转导途径，在转基因植株中其平均表达量高于野生型植株近50%(图 8f).

    BAK1，BAS1，BES1，BZR1，BIN2，BSKs都参与了BR合成的转录调控，调节内源BR水平，在pCABarDWF4转基因芥菜植株中，随着DWF4基因表达水平的提高，大多数调控基因BAK1，BZR1，BIN2和BSKs的表达量与DWF4表达量呈正相关，出现明显上调. 而维系细胞内内源BR稳定水平的BAS1基因，则在不同植株之间的表达水平变化小.

3.   讨论

    3.1.   DWF4基因超表达对芥菜生长发育的影响

  • DWF4编码C22羟基化酶，其转录水平受BR反馈抑制，其可以迅速而准确地对内源BR水平响应表达变化[11, 14]，是BR合成关键基因之一. 在拟南芥中，不论是光照还是黑暗条件下，通过超表达DWF4基因，拟南芥幼苗下胚轴长度远远高于对照野生型[2]，本实验中，在芥菜中超量表达DWF4基因后，与野生型相比，转基因苗期根茎伸长变快，与在拟南芥中的实验结果一致. 在拟南芥和烟草中超表达DWF4基因，其成熟植株花序高度分别增加了35%和14%，与野生型相比，在拟南芥中超表达DWF4基因将增加近两倍的分枝数和结荚数，结子量升高[2]. 而在本实验中，通过在芥菜中超表达DWF4基因，转基因芥菜所结种子数是野生型的近2.5倍，说明超表达DWF4基因可以大幅度促进植株产量提高. 在拟南芥中超表达DWF4基因将使植株叶片叶柄伸长，开花时间提前，转基因植株生长更加旺盛[15]. 在本文图 4和图 5中可以看出，芥菜超表达DWF4基因使植株株高、开展度、最大叶长和最大叶宽皆比同时期野生型增高，转基因植株抽薹开花时间提前. 说明DWF4基因对植株生长发育有促进作用，因此增强了植株生长势，植株生长更加旺盛可能也与转基因植株产量提高息息相关.

    • 3.2.   DWF4基因超表达对BR合成调控途径相关基因表达的影响

  • DWF1诱导24-亚甲基胆甾醇(24-methylenecholesterol)转变为芸薹甾醇(Campesterol)[16]，是BR前期合成的重要基因. 在本文中，超表达DWF4基因并没有太多影响DWF1基因的表达，可能是DWF1作用与DWF4基因上游有关. DET2，5-α还原酶被认为是油菜素内酯生物合成酶关键元件，其催化菜油甾醇转化为菜油甾烷醇，是油菜素内酯合成过程中催化较早反应的酶[17]. 在本实验中，超表达DWF4基因促进了DET2的表达，特别是D2和D3植株，表达量超出了野生型植株约2倍，说明DWF4基因正调控DET2的表达. ROT3编码细胞色素P450(CYP90C1)，在叶和花的形成发展期间，与细胞极性伸长相关[18]，在BR生物合成途径中，ROT3与CYP90D1起着共同催化C23羟基化的作用[19]. 在本实验中，ROT3表达量在转基因植株中表达较高，远远超过野生型植株，说明超量表达DWF4基因促进了ROT3基因的表达. 有报道称CPD基因编码一种重要的BR合成酶(CYP90A1)，催化C23羟化反应，代谢油菜甾醇(campesterol)和其他中间产物，Ohnishi等[20]则发现CPD基因参与C3氧化反应. 在本实验中，超表达DWF4基因使得CPD表达量降低，说明DWF4负调节CPD基因，这可能是DWF4基因和CPD基因具有相似性，在BR合成途径中作用位点有相同之处，因此两者产生了抑制作用. CYP85A2调节内源CS水平从而控制BR中C28和C27生物合成途径，在C6氧化途径中，CYP85A2比CYP85A1更加有活性，通过超表达和对两个基因突变体的观察研究也证实了此结论. 在拟南芥中，CYP85A1对CYP85A2起到辅助作用促进BR合成[21]，在本实验中，超表达DWF4基因促进了CYP85A1和CYP85A2的表达，而且CYP85A2基因表达量升高更多，佐证了CYP85A2基因比CYP85A1基因活性更强、作用更强的结论，而CYP85A2基因是BR生物合成途径中最后一步反应的重要因子，因此CYP85A2基因表达量的升高证实转基因植株体内BR浓度水平的升高. 所以，超表达DWF4基因促进了植株体内BR合成途径中的相关基因，促进了内源BR的生成.

    BAK1编码一个由615个氨基酸组成的蛋白，是一个典型的受体激酶，其在植物体内广泛表达，参与调控BR信号[22]，在芥菜中超表达DWF4基因促进了BAK1的表达. BAS1编码一种C26羟化酶，催化CS和BL分别生成26-OH-CS和26-OH-BL，从而使BL功能失活，以维持体内活性BL的静态平衡，在内源BL含量高的组织器官中活跃表达[23]. 但是在本实验中，超表达DWF4基因并没有显著提高BAS1的表达量，其中的内在机理还需进一步研究. 核内蛋白BZR1和其同系物BES1是BR信号途径中的两个重要转录因子，被PP2A蛋白介导脱去磷酸化，去磷酸化后的BZR1和BES1在细胞核中调节将近1 000个靶基因，从而调节植物生长. ChIP-qPCR实验显示BZR1和BES1可以结合DWF4基因和BR诱导基因SAUR-AC1[24]. 在本文中，BES1和BZR1两个基因在转基因植株中表达量远远高于野生型植株，说明超表达DWF4基因促进了转基因植株内源BR提高，因此BES1和BZR1基因转录水平升高从而维持植株体内BR平衡. BR结合BRI1感受器激活BIN2，调节植株生长，BIN2对BES1和BZR1这两个转录因子的磷酸化起着重要作用，是BR信号途径中重要的调控因子[25]. BIN2基因的表达应与BES1和BZR1基因表达相一致. 在本文实验结果中，BIN2基因的表达与BZR1基因表达趋势基本一致，在转基因植株中表达量升高，这与理论结果相同. 拟南芥质膜蛋白组学研究发现BR信号激酶BSKs，磷酸化的BSKs可以和BR受体激酶BRI1相互作用[26]. 在图 8中可以得知，超表达DWF4基因促进了BSKs的表达. 综上所述，通过定量PCR[27]实验结果显示，超表达DWF4基因促进了植株内源BR水平的提高，因此维持体内BR平衡的BAK1，BAS1，BES1，BZR1，BIN2，BSKs基因都各有升高.

Figure (8)  Table (3) Reference (27)

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