Killing Activity of Polypyridine Iridium Complex on Candida albicans in vitro and in vivo

FU Chen; ZHOU Wei; ZHAO Zizhen; FU Ailing

doi:10.13718/j.cnki.xdzk.2022.12.008

Candida albicans infection is a common zoonotic disease. The development of innovative drugs with anti-Candida albicans activity will help to vigorously promote the development of clinical treatment. This study will determine that a fluorescent polypyridine complex can enter Candida albicans cells, and show a strong effect of killing the fungus in vivo and in vitro, which will provide a new method for the clinical treatment of Candida albicans infectious nephritis. The intracellular uptake of the complex by Candida albicans was detected by using fluorescence observation, and then the anti-Candida albicans effect of the complex was determined by methylene blue staining. The antifungal activity of the complex was further verified by the study of relationships of dose-effect and time-effect. The minimum inhibitory concentration(MIC) and minimum fungicidal concentration(MFC) of the complex to kill Candida albicans also were determined. Moreover, the antifungal effect of the complex in vivo was evaluated in the nephritis model of Candida albicans infection. The results Showed: The MIC and MFC of the complex against Candida albicans were 1 μg/mL and 2 μg/mL, respectively. The antifungal activity of the complex was stronger than that of fluconazole. In addition, the complex could reduce Candida albicans load in the kidney of animal model, and decrease renal inflammatory injury, showing the therapeutic effect.

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白色念珠菌(Candida albicans)是一种常见的条件致病性真菌，广泛分布于人类和犬、猫、猪等动物的口腔、胃肠道表面与生殖器^[1]. 在继发感染或者免疫功能低下的动物中，白色念珠菌可传播到血液中，造成危及生命的系统性白色念珠菌病. 据报道，系统性白色念珠菌病的死亡率可超过30%^[2]. 此外，临床上发现了多种耐药型的白色念珠菌菌株^[3]. 因此，探索具有新化学结构的新型抗白色念珠菌药物变得愈加紧迫.

近10多年来，多吡啶类的过渡金属配合物是化学生物学与药物化学领域的研究热点. 其中，铱和钌的多吡啶类配合物的空间结构、电子性质可以通过其结构配体和辅助配体的修饰而进行分子设计，并且它们还可以与特定的生物分子发生配体交换反应，因而被广泛运用于抗微生物和抗癌药物的研究中^[4]. 研究发现，多吡啶铱配合物具有较强的抑制金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌等细菌生长的作用^[5-6]. 然而，鲜有关于多吡啶铱配合物尚有抗白色念珠菌活性的报道.

本研究在以往合成的一系列金属配合物的工作基础上，筛选出了一种新型结构的多吡啶铱配合物，该配合物在激发光下，可显示出黄色荧光(图 1). 在抗菌功能检测中，确定了它们对白色念珠菌的最小抑菌质量浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)和最小杀菌质量浓度(minimum fungicide concentration，MFC)，并且研究发现该配合物在动物体内对白色念珠菌也有显著的杀灭作用.

1. 材料和方法

1.1. 材料和仪器

1.1.1. 仪器

电子分析天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)，倒置荧光显微镜(重庆奥特光学仪器有限责任公司)，酶标仪(美国Hercules公司)，恒温箱(湖南湘仪公司)，荧光分光光仪(日本HITA-CHI公司)，高速台式冷冻离心机(湖南湘仪公司)，冷冻切片机(德国得卡公司).

1.1.2. 试剂

本课题组根据文献[7]合成一系列配合物，氟康唑购于北京索莱宝科技有限公司，亚甲基蓝购于上海阿拉丁公司.

1.1.3. 菌株与培养条件

白色念珠菌(ATCC 90029)购于北京百欧博伟生物技术有限公司. 将购得的白色念珠菌培养于SDA琼脂平板(含有1%蛋白胨、4%葡萄糖、2%琼脂)上，在28 ℃恒温培养.

1.2. 方法

1.2.1. 白色念珠菌对配合物的摄取实验

从SDA琼脂平板上挑取白色念珠菌单菌落，于培养基中过夜培养. 离心收集真菌细胞，用磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline，PBS)洗涤2次，并于RPMI 1640培养基中调整菌落浓度为1×10⁶ CFU/mL，然后加入4 μg/mL的配合物，在28 ℃孵育2 h. 使用荧光倒置显微镜观测白色念珠菌对配合物的摄取情况.

1.2.2. 亚甲基蓝染色

由于亚甲基蓝不能进入活细胞但可进入死亡的细胞，因此可用亚甲基蓝染色鉴定配合物杀灭真菌细胞的效果. 收集对数生长期的白色念珠菌，重悬于RPMI 1640培养基中，使其浓度为5×10⁵ CFU/mL. 加入4 μg/mL或8 μg/mL的配合物，在28 ℃孵育24 h，离心收集细胞，用PBS洗涤与重悬，取1滴于载玻片上用亚甲基蓝染色3 min，在显微镜下进行观察. 使用氟康唑(4 μg/mL)作为阳性对照.

1.2.3. 时效曲线研究

将白色念珠菌分别与不同质量浓度的配合物(0，2，4 μg/mL)在28 ℃孵育0，4，8，12，24，36，48 h，然后吸取100 μL培养液，平铺于YPD平板上，在28 ℃培养24 h，根据单菌落数来确定活细胞数量，并使用GraphPad Prism 7.0绘制出时效曲线.

1.2.4. MIC和MFC的测定

参照CLSI M27-A3标准^[8]，采用微量肉汤稀释法测量配合物对白色念珠菌的MIC和MFC. 离心收集处于对数生长期的真菌细胞，重悬于RPMI 1640培养基中，使其终浓度为1.5×10³ CFU/mL，然后加入质量浓度为64~0.125 μg/mL的配合物. 培养48 h后，得到最低药物质量浓度和抑制率大于50%的药物质量浓度.

1.2.5. 动物感染白色念珠菌模型的制作

雄性健康Balb/c小鼠(6~8周)，购于重庆恩斯维尔生物科技有限公司，饲养在SPF级实验室中. 每只小鼠每天腹腔注射80 mg/kg环磷酰胺一次，连续3 d，以降低机体免疫力^[9]. 然后每只小鼠经尾静脉注射给予对数生长期的白色念珠菌(5×10⁵ CFU)进行感染^[10-11].

1.2.6. 体内抗菌实验

在白色念珠菌感染1 d后，将感染模型小鼠平均分为3组(每组6只小鼠)：模型组、氟康唑阳性药治疗组和配合物治疗组. 配合物治疗组小鼠经腹腔注射4 mg/kg配合物. 阳性药治疗组小鼠腹腔注射4 mg/kg氟康唑，模型组给予同等剂量的生理盐水. 连续给药3 d后处死小鼠，分离出肾脏，分别进行高碘酸-席夫碱(PAS)和苏木素-伊红(HE)染色^[12]，同时测定肾组织菌落负荷量. 测定菌落负荷量时，在无菌条件下将肾组织匀浆，然后涂布于培养板上. 在28 ℃培养48 h后，得到单菌落数，计算菌落负荷量(菌落数/肾脏质量).

1.2.7. 数据分析

所有数据均采用GraphPad Prism 7.0进行统计分析. 两组数据间的比较使用t检验，ANOVA用于多组数据的分析. p＜0.05被认为具有统计学意义.

3. 结论

在目前真菌感染引起的发病率和死亡率均上升的趋势下，研制新型抗真菌药物是一个重要的课题. 本实验研究了八面体型的铱(Ⅲ)配合物的抗白色念珠菌活性，发现这类金属配合物可能具有研究价值和应用空间. 从中筛选得到的配合物对于白色念珠菌具有良好的杀菌活性，其MIC和MFC分别为1 μg/mL和2 μg/mL，活性高于临床抗真菌药物氟康唑. 在系统性白色念珠菌感染的动物模型中，配合物也表现出一定的治疗效果. 本研究可为合成新型的多吡啶铱配合物抗菌药物提供有效结构，也可为开发新型金属抗菌剂提供参考.

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通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com

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