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2019 Volume 44 Issue 7
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Peng-xi LI, Zhong-hong LIU, Ling-ling YANG, et al. Design, Synthesis and Biological Activity of R8-Modified Reduction-Sensitive Targeting Photosensitizer[J]. Journal of Southwest China Normal University(Natural Science Edition), 2019, 44(7): 23-29. doi: 10.13718/j.cnki.xsxb.2019.07.004
Citation: Peng-xi LI, Zhong-hong LIU, Ling-ling YANG, et al. Design, Synthesis and Biological Activity of R8-Modified Reduction-Sensitive Targeting Photosensitizer[J]. Journal of Southwest China Normal University(Natural Science Edition), 2019, 44(7): 23-29. doi: 10.13718/j.cnki.xsxb.2019.07.004
shu

Design, Synthesis and Biological Activity of R8-Modified Reduction-Sensitive Targeting Photosensitizer

  • 1.

    School of Environmental and Quality Detection, Chongqing Chemical Industry Vocational College, Chongqing 401228, China

  • 2.

    Department of Occupational Health, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China

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  • Corresponding author: Bing YANG
  • Received Date: 24/06/2018
    Available Online: 20/07/2019

  • MSC: O625.6

  • The present study reported the preparation of a novel R8-modified redox-reponsive prodrug containing meso-tetra (m-hydroxy phenyl) chlorin (m-THPC), octaarginine(R8) and folate. The structure of target compound was characterized by UV-Vis, IR, HPLC, 1HNMR, MS spectra. The results show that the introduction of octa-arginine can significantly improve the solubility of m-THPC and increase the targeting property for tumor cells. m-THPC can be released from photosensitizer 1 under the action of GSH, and the release rate was more than 80% at 6 h. The cytotoxicity test showed that the survival rate of HeLa cell can be reduced to 36.1% whenthe concentration of photosensitizer 1 is 15 μmol/L, and the cytotoxicity of photosensitizer 1 is stronger than photosensitizer 7.
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通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com
  • 1. 

    沈阳化工大学材料科学与工程学院 沈阳 110142

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Design, Synthesis and Biological Activity of R8-Modified Reduction-Sensitive Targeting Photosensitizer

    Corresponding author: Bing YANG
  • Received Date: 24/06/2018
  • Available Online: 20/07/2019

Abstract: The present study reported the preparation of a novel R8-modified redox-reponsive prodrug containing meso-tetra (m-hydroxy phenyl) chlorin (m-THPC), octaarginine(R8) and folate. The structure of target compound was characterized by UV-Vis, IR, HPLC, 1HNMR, MS spectra. The results show that the introduction of octa-arginine can significantly improve the solubility of m-THPC and increase the targeting property for tumor cells. m-THPC can be released from photosensitizer 1 under the action of GSH, and the release rate was more than 80% at 6 h. The cytotoxicity test showed that the survival rate of HeLa cell can be reduced to 36.1% whenthe concentration of photosensitizer 1 is 15 μmol/L, and the cytotoxicity of photosensitizer 1 is stronger than photosensitizer 7.

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  • 光动力治疗(PDT)是利用光敏剂，在一定波长的光照射下，引发光化学反应，产生单线态氧，进而破坏肿瘤，达到治疗肿瘤的目的.目前，第一代光敏剂——血卟啉，因组分复杂、肿瘤靶向性不足、作用深度较浅等缺点，逐渐被第二代光敏剂——替莫卟吩(m-THPC)所取代[1-4].与血卟啉相比，m-THPC具有较高的细胞毒性、肿瘤选择性和较深的作用深度等优点，但存在水溶性不足、肿瘤靶向性差、光毒性等缺点.由于肿瘤组织的代谢异常，导致大部分肿瘤细胞的叶酸受体高表达，且叶酸受体与叶酸具有较高的亲和性[5-7].基于上述原因，前期研究中将羧酸卟啉与叶酸偶联，成功制备了叶酸-羧酸卟啉偶联物，细胞实验发现，与羧酸卟啉相比，宫颈癌细胞(Hela细胞)对叶酸-羧酸卟啉的摄取是羧酸卟啉的35倍，且具有较强的光毒性和较低的暗毒性[8].但叶酸-羧酸卟啉的水溶性不足和卟啉的光动力活性较低，限制其广泛应用.因此，本研究利用叶酸、羧酸卟吩和聚乙二醇二氨(NH2-PEG-NH2)，以酰胺键偶联，制备了一种叶酸-PEG-羧酸卟吩(光敏剂7)，其分子式为

    光敏剂7在水中的溶解度为40.1 mg/L，细胞靶向性和毒性也远高于羧酸卟吩.然而，光敏剂7仍存在相对分子质量较大、组分不定、光敏剂化学结构改变等问题，导致光动力活性受到影响[9].

    正常组织细胞内谷胱甘肽(GSH)的浓度是细胞外液中的200倍以上，且肿瘤细胞内的GSH是正常细胞的7~10倍，导致肿瘤细胞内具有较强的还原性.因此，还原敏感型药物递送系统成为人们研究的热点.还原敏感型药物主要通过二硫键与GSH的巯基进行可逆转换而实现[10-11].多肽具有合成简单、对肿瘤有被动靶向、多肽修饰的光敏剂能改善油-水分配系数等优点[12-13].因此，本研究采用叶酸受体介导的叶酸靶向策略，m-THPC作为光敏剂，引入穿膜肽八聚精氨酸(R8)连接基团，同时以二硫键为化学键，成功制备了还原敏感型叶酸-多肽-m-THPC(光敏剂1)，并对光敏剂1的生物活性进行探究.

1.   实验部分

    1.1.   主要仪器与试剂

  • 主要仪器：Varian 640型红外光谱仪(美国Varian公司)；DU800型紫外可见分光光度计(美国Beckman公司)；Mercuryplus-400 MHZ核磁共振仪(美国Varian公司)；Agilent 1200液相色谱仪(美国Agilent公司)；KDH 150B红光治疗仪(输出波长600~700 nm，北京科电微波电子有限公司)；AXIMA Resonance Lcms 2010质谱仪(日本岛津公司).

    主要试剂：9-芴甲氧羰基-(三苯甲基)半胱氨酸王树脂(Fmoc-Cys(Trt)-王树脂)、9-芴甲氧羰基-精氨酸8-COOH(Fmoc-(Arg)8-COOH)、六氟磷酸苯并三氮唑-1-氧基三吡咯烷基磷(PyBop)、N，N-二异丙基乙基胺(DIPEA)和1-羟基苯并三氮唑(HOBT)均购于上海吉尔生化有限公司；二甲亚砜、吡啶、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、三氟乙酸(TFA)、三乙胺、碳酸三氯甲基酯(三光气)、三异丙基硅烷(TIS)、1，2-乙二硫醇(EDT)和肼均购于中国国药集团；叶酸(FA)(Sigma公司，美国)，反相硅胶(ODS-AQ，YMC公司，日本)，透析袋(MWCO=1 000，生工生物，上海).二甲亚砜、吡啶和DMF在使用前均经减压蒸馏处理；其余试剂均为AR，使用前未经处理.

    • 1.2.   高效液相色谱条件

  • 色谱柱为300 extend C18柱(5 μm，4.6×150 mm)；流动相A为5%乙腈-水溶液(含0.1%三氟乙酸)，流动相B为乙腈(含0.1%三氟乙酸)，梯度洗脱，在15 min内流动相A从100%到0%，流速：1 mL/min；柱温：25 ℃；进样量：10 μL；紫外可见吸收检测器检测波长：410 nm.

    • 1.3.   还原敏感型叶酸-多肽-m-THPC光敏剂1的合成

    1.3.1.   化合物4的合成

  • 在氩气保护下，将90.62 mg(0.48 mmol)2-(2-羟基-乙二硫)吡啶[14]、0.067 mL(0.48 mmol)三乙胺和47.93 mg(0.48 mmol)三光气溶于15 mL二氯甲烷中，室温反应10 min后，滴加至含有300 mg(0.44 mmol)m-THPC和0.067 mL(0.48 mmol)三乙胺的15 mL在乙腈中，室温反应6 h，减压蒸干溶剂，反相硅胶(ODS-AQ，甲醇)柱色谱分离，得到60.43 mg化合物4，产率为15.36%. UV-Vis (CH3OH)：414，514，540，594和648 nm；1HNMR (500 MHz，DMSO-d6)：δ9.81，8.72~8.21 (m，6H，CH，Pyrrole)，8.21~7.06 (m，20H)，4.48 (s，2H，-CH2-，-OCH2-)，4.17 (s，4H，-CH2-，Pyrrole)，3.23 (s，2H，-CH2-，-CH2S-)，1.23 (s，2H，-NH-)；MS (ESI)：894.1722 (M + H)；HPLC：96.6%.

    • 1.3.2.   化合物6的合成

  • 采用多肽固相合成法，在氩气保护下，将1.0 g Fmoc-Cys(Trt)-王树脂置于接肽瓶中，加入2 mL哌啶DMF(20%)，振荡1 h，减压抽滤，重复3次，用DMF(3 mL × 3)和异丙醇(3 mL × 3)冲洗树脂，得H2N-Cys(Trt)-王树脂.称取1.19 g Fmoc-(Arg)8-COOH(0.8 mmol)溶于5 mL DMF，加入1.04 g PyBOP(2 mmol)、0.27 g HOBT(2 mmol)和0.41 g DIPEA(3.2 mmol)，在氩气保护下，室温反应30 min，加入H2N-Cys(Trt)-王树脂，室温反应4 h，用DMF(5 mL × 3)和异丙醇(5 mL × 3)冲洗树脂，减压抽干，加20%哌啶DMF(2 mL × 3)，振荡1 h，减压抽滤，得H2N-(Arg)8-Cys(Trt)-王树脂.将0.35 g叶酸(0.8 mmol)溶于5 mL混合溶剂(n(DMF)：n(DMSO)=1:3)，加入1.04 g PyBOP(2 mmol)、0.27 g HOBT(2 mmol)和0.41 g DIPEA(3.2 mmol)，在氩气保护下，室温活化30 min，加入H2N-(Arg)8-Cys(Trt)-王树脂，室温反应12 h.用DMF(5 mL × 3)和DCM(5 mL× 3)冲洗树脂，减压抽干，得FA-(Arg)8-Cys(Trt)-王树脂.将FA-(Arg)8-Cys(Trt)-王树脂置于接肽瓶中，在氩气保护下，加入2%肼DMF(2 mL × 3)，室温反应10 min，减压抽干，用DMF(5 mL × 3)和异丙醇(5 mL × 3)冲洗树脂，减压抽干.加入4 mL混合溶剂(n(TFA):n(H2O):n(TIPS):n(EDT)=92.5:2.5:2.5:2.5)，反应30 min，重复3次，收集滤液，真空干燥，得到FA-(Arg)8-Cys-SH粗品.反相硅胶柱色谱分离(40%乙腈水)，得到0.53 g纯品. MS(MALDI-TOF)：m/z 1793.96；HPLC：98.6%.

    • 1.3.3.   光敏剂1的合成

  • 光敏剂1的合成路线见图 1.在氩气保护下，将50 mg化合物6(0.0278 mmol)溶于5 mL水中，用饱和Na2CO3溶液调节pH值至6.8，将该溶液加至溶有24.9 mg化合物4(0.0278 mmol)的5 mL DMSO中，室温反应2 h，透析，冷冻干燥，反相硅胶柱色谱分离(45%乙腈水)，得到8.64 mg光敏剂1，产率为12.06%. 1HNMR (500 MHz，DMSO-d6) δ：8.72(s，β-H，Pyrrole)，8.24~8.39(s，2H，ArH)，8.03~8.09(m，4H，ArH)，7.41~7.52(m，ArH)，4.54(m，-CH2-，Arg)，4.19~4.24(m，-CH2-，Arg)，3.50(t，-CH2-，Arg)，1.73~1.76；MS(MALDI-TOF)：m/z 2575.18；HPLC：99.1%.

    • 1.4.   测定还原敏感型光敏剂1的生物活性

    1.4.1.   光稳定性和溶解性

  • 将还原敏感型光敏剂1和光敏剂7溶于10 mmol/L的磷酸盐缓冲液(PBS，pH=7.0)，配制成浓度为12 μmol/L的溶液，在暗室中，用红光治疗仪在600~700 nm下光照射，分别于0，5，10，20，40，80，120 min取样，测定吸光度.光稳定性的计算公式为：ASoret (120 min)/ASoret (0 min) × 100%.

    将过量的还原敏感型光敏剂1和m-THPC分别溶于1 mL水中，振荡2 h，涡旋10 min，保证溶解完全，在转速为12 000 r/min条件下离心40 min，取上清液，冷冻干燥，准确称量，获得溶解度.

    • 1.4.2.   药物释放研究

  • 将还原敏感型光敏剂1(0.01 mmol，25.77 mg)溶于PBS(10 mL)中，配制成浓度为1 mmol/L的溶液，迅速加入5倍GSH(0.05mmol，15.37mg)，在37 ℃涡旋混匀，分别于0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，4.0和6.0 h取样，离心，取上清液，微孔滤膜过滤后，供HPLC分析.

    • 1.4.3.   肿瘤靶向性测定

  • 将浓度为5 × 104个/mL的人宫颈癌HeLa细胞株(叶酸受体阳性细胞)和人肺腺癌A549细胞(叶酸受体阴性细胞)分别接种于6孔板上，在无叶酸的1640(10%胎牛血清)培养24 h，各设3个试验组.试验组1为在孔中加入还原敏感型光敏剂1，终浓度为16.5 μmol/L；试验组2为在孔中加入光敏剂7，终浓度为16.5 μmol/L；试验组3为同时在孔中加入还原敏感型光敏剂1和FA，其中靶向光敏剂的终浓度为16.5 μmol/L，叶酸的终浓度为3 mmol/L.各实验组培养24 h后弃培养液，DPBS洗涤3次，每孔用4%多聚甲醛固定30 min，吸出液体，DPBS洗涤，甘油封片，激光共聚焦测定各孔细胞中光敏剂的荧光强度(Ex：480 nm；Em：660 nm).

    • 1.4.4.   细胞毒性研究

  • 于96孔培养板中接种浓度为5 × 104/mL的HeLa细胞2孔，各分15个组，培养至对数生长期，除对照组外，各组分别加入浓度为0.5，0.9，1.9，3.8，7.5，15.0，30.0，60.0和120.0 μmol/L的光敏剂1和7，培养24 h，冷PBS洗3次，加新鲜培养液，分别用红光治疗仪照射5 min.光照后继续培养24 h，加含MTT(5 g/L)的PBS溶液20 μL，培养4 h，弃去培养液，加入100 μL DMSO，振荡10 min，用酶标仪测定吸光值(570 nm)，计算细胞存活率：SR =实验组OD值/对照组OD值× 100%.

2.   结果与讨论

    2.1.   光敏剂1的制备

  • 在中间体化合物4的制备中，采用2-(2-羟基-乙二硫)吡啶作为双硫键的引入基团，在三光气和三乙胺的条件下，得到的产率为15.36%.产率较低的原因在于，三光气活性较高，得到的产物不仅有一取代，还有二取代和三取代的副产物；为提高产率，可采用缓慢滴加的方式，将活化后的2-(2-羟基-乙二硫)吡啶，滴加至m-THPC溶液中.

    光敏剂1的制备，是利用双硫键可以发生交换反应，但该反应为可逆反应，为获得较高的产率，应控制反应pH值在6~7之间.在弱酸性条件下，生成副产物巯基吡啶，会成盐，进而降低与光敏剂1发生巯基交换反应的可能性.因此，通过对反应pH值的控制，可以实现多肽修饰的还原敏感型叶酸靶向光敏剂1的制备.

    • 2.2.   光稳定性和溶解性

  • 以水为溶剂，测得光敏剂1的溶解度为13.32 mmol/L；m-THPC溶解后，离心，取上清液，UV-vis光谱分析，未见明显吸收峰，说明m-THPC在水中几乎不溶解.因此，八聚精氨酸的引入可显著改善光敏剂在水中的溶解度.

    图 2为光敏剂1和光敏剂7的光稳定性实验结果.结果表明，在5 min内，光敏剂1和光敏剂7的稳定性分别下降18.39%和33.56%；光照10 min后，光敏剂1和光敏剂7的稳定性分别下降36.67%和39.70%.光照大于10 min，光敏剂1的稳定性小于光敏剂7.

    • 2.3.   药物释放

  • 在PBS(pH=7.0)、37 ℃和GSH作用下，还原敏感型光敏剂1可释放出母体药物m-THPC，6 h后释放率大于80%(图 3).

    通过对光敏剂1的化学结构分析和文献调研，光敏剂1释放母体药物m-THPC的机理见图 4，其释放属于1，2-消除机理[15-16].

    • 2.4.   肿瘤靶向性

  • 如图 5所示，在叶酸受体阳性细胞(HeLa)中光敏剂1和光敏剂7的荧光强度明显大于在叶酸受体阴性细胞(A549)中的荧光强度，即叶酸受体阳性细胞对光敏剂的摄取明显强于叶酸受体阴性细胞，且光敏剂1的吸收作用被大量加入的自由叶酸所抑制，说明光敏剂1的摄取是由肿瘤细胞表面的叶酸受体介导的内吞作用.光敏剂7的摄取是叶酸受体介导的内吞作用已在前期研究中被证实.

    HeLa细胞和A549细胞中，光敏剂1的荧光强度大于光敏剂7的荧光强度，说明肿瘤细胞对光敏剂1的吸收高于光敏剂7.八聚精氨酸(R8)已被证实是一种良好的肿瘤细胞穿膜肽，光敏剂1中引入R8，可提高光敏剂1的肿瘤细胞靶向作用.

    • 2.5.   细胞毒性

  • 图 6为光敏剂1和光敏剂7的细胞毒性随浓度变化的实验结果.结果表明，在浓度为0.5~120μmol/L时，光敏剂1和光敏剂7的细胞毒性随浓度的增加而增加.当浓度为15μmol/L时，光敏剂1和光敏剂7对HeLa细胞的存活率分别降低至36.1%和39.7%.由于穿膜肽R8的靶向作用，导致光敏剂1的摄取大于光敏剂7，进而光敏剂1的细胞毒性大于光敏剂7.

3.   结论

  • 采用八聚精氨酸(R8)为连接基团，叶酸为靶向基团，m-THPC为光敏剂，通过形成双硫键，制备了一种多肽修饰的还原敏感型光敏剂.研究发现，光敏剂1在水中的溶解度为13.32 mmol/L；在GSH作用下，6 h内光敏剂1释放率大于80%，文献分析发现，释放机理属于1，2-消除机理.细胞靶向性实验表明，穿膜肽R8的引入对肿瘤细胞的摄取具有协同作用，与光敏剂7相比，光敏剂1的细胞摄取率大于光敏剂7.细胞毒性实验证明，当光敏剂1浓度为15 μmol/L时，光敏剂1对HeLa细胞的存活率为36.1%，光敏剂7对HeLa细胞的存活率为39.7%，光敏剂1的细胞毒性高于光敏剂7.

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