Establishment of a ERA Method for Detecting Fusarium oxysporum in Soybean

大豆尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)^[2]、大豆灰斑菌(Cercospora sojina)、茄腐镰刀菌(Haematonectria haematococca)、东北霜霉菌(Peronospora manschurica)、锐顶镰孢菌(Fusarium acuminatum)、腐皮镰孢菌(Fusarium solani)均为吉林农业科技学院农学院赠送。

基础型核酸扩增试剂盒(ERA法)购自苏州先达基因科技有限公司；十二烷基磺酸钠(SDS)、DL 500bp DNA Marker购自上海生物工程有限公司；十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、月桂酰肌氨酸钠(N-Methylglycinol)购自天津福晨化学试剂有限公司；四正丁基溴化铵(TBAB)购自上海生物工程有限公司；自聚乙烯吡咯烷酮(PVP)购自飞科生物科技有限公司；β-巯基乙醇(BME)购自天津大茂化学科技有限公司；核酸提取磁珠(通用型)购自迈途医药科技有限公司；DL 15000bpDNA Marker、Premix Ex Taq Version 2.0(Loading dye Mix)购自宝日医生物技术有限公司^[3]。

台式高速冷冻离心机(Centrifuge 5430R，德国艾本德公司)；恒温水浴锅(HH-12468，常州郎越仪器制造有限公司)；电泳仪(DYY-60，北京六一生物科技有限公司)；紫外分光光度计(BioSpec-nano，日本岛津公司)；高压灭菌锅(MVS-83，北京冠普佳科技有限公司)；凝胶成像仪(GenoSens 2000，上海勤翔科学仪器有限公司)。

将用液氮研磨提取后的粉末状真菌，立即用800 μL预热后的SDS裂解液溶解，并加入40 μL β-巯基乙醇，振荡混匀，55 ℃水浴40 min，且每隔5 min振荡混匀1 min，12 000 r/min、4 ℃条件下离心10 min^[7]。取上清液于新管中，加入等体积的事前配制好的酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)，上下颠倒1 min混匀后，12 000 r/min、4 ℃条件下离心10 min^[8]。取上清液加入2倍体积预冷的无水乙醇，-20 ℃冰箱静置20 min，离心管内会出现半透明的絮状沉淀，离心管朝一个方向轻轻旋转，使絮状基因组缠绕，12 000 r/min、4 ℃条件下离心8 min，沉淀用预冷的70%乙醇洗涤后10 000 r/min离心5 min(重复2次)，弃上清液，然后在超净工作台上放在冰上晾干，然后加入30 μL TE溶解和3 μL RNaseA去除RNA，测浓度后于约20 ℃冰箱保存备用。

将用液氮研磨提取后的粉末状真菌装管后立即加入预热的SDS-盐酸胍混合裂解液1 mL，振荡混匀，55 ℃水浴40 min，且每隔5 min振荡混匀1 min，其后步骤同SDS法^[8]。

将用液氮研磨提取后的粉末状真菌，迅速装管后加入预热的月桂酰肌氨酸钠裂解液1 mL，振荡混匀，55 ℃水浴40 min，且每隔5 min振荡混匀1 min，后续操作同SDS法^[9]。

将用液氮研磨提取后的粉末状真菌装管后，立即加入预热后含有2.5 mol/L四正丁基溴化铵的SDS-盐酸胍混合裂解液1 mL，振荡混匀，55 ℃水浴40 min，且每隔5 min振荡混匀1 min，后续操作同SDS法^[10]。

将用液氮研磨提取后的粉末状真菌，装管后迅速加入800 μL预热的2% CTAB裂解液，20 μL蛋白酶K，振荡混匀，55 ℃水浴40 min，且每隔5 min振荡混匀1 min，其后步骤同SDS法。

利用已知引物EF、ITS、RPB2(引物序列见表 1)对大豆尖孢镰刀菌进行多次常规PCR扩增鉴定，PCR扩增体系为：正反向引物2.5 mmol/L各添加2 μL，终浓度为30 ng/μL的基因组0.8 μL，Premix Ex Taq Version 2.0(Loading dye Mix)12.5 μL，用水补充至25 μL。程序设定：预变性94 ℃ 5 min，变性94 ℃ 30 s，退火57 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 1 min，30个循环，后延伸72 ℃10 min。琼脂糖凝胶电泳检测后，将PCR反应产物送至生工上海生物工程有限公司测序并与NCBI上大豆尖孢镰刀菌进行序列比对^[11]。

在NCBI上选择并下载大豆尖孢镰刀病菌和本实验中所用真菌的基因组序列，利用SnapGene软件和NCBI网站进行比对分析，同时进行文献筛查，最终经过多个基因的筛选确定能特异性扩增的基因CYP 505，作为特异性片段并进行引物设计^[10]。

根据目的片段的基因序列，利用Primer 5.0引物设计软件设计引物如表 1所示，均交于生工上海生物工程有限公司合成^[4]。

使用苏州先达基因科技有限公司的基础型ERA试剂盒进行ERA扩增。首先将基础反应试剂从-20 ℃冰箱中取出并室温放置10 min。反应体系：ddH₂O 21 μL、溶解剂20 μL、正反向引物各2.5 μL、10 ng/μL基因组2 μL、激活剂2 μL(加入到管盖内侧，防止激活剂提前进入反应管内开始反应而影响试验)，同时用ddH₂O制备阴性对照，混匀离心后立即于40 ℃水浴锅中孵育20 min，取出加入6×loading buffer于56 ℃孵育5 min，最后用2.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，电泳条件设定为80 V恒压，电泳时间55 min，电泳结束后对6个引物组合的电泳结果进行分析，筛选出最佳引物对^[12]。

确定最佳引物探针浓度组合，设置37 ℃、38 ℃、39 ℃、40 ℃、41 ℃、42 ℃ 6个反应温度^[13]。根据步骤“2.4”中筛选出的最佳引物对配制相同反应体系，并利用ddH₂O制备阴性对照，于相对应的6个温度条件下孵育20 min，时间到后立即取出并加入6×loading buffer，于56 ℃孵育5 min，反应结束后进行2.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，电泳条件设定为80 V恒压，电泳时间55 min^[5]，电泳结束后对电泳结果进行分析。

以10 min为反应起始时间，每隔5 min设置一个反应时间直到30 min.，根据步骤“2.4”中筛选出的最佳引物对配制相同反应体系，并利用ddH₂O制备阴性对照，采用步骤“2.5.1”中最佳反应温度分别孵育10 min、15 min、20 min、25 min、30 min，时间到后取出并加入6×loading buffer，于56 ℃孵育5 min，反应结束后进行2.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，电泳条件设定为80 V恒压，电泳时间55 min，电泳结束后对电泳结果进行分析^[14]。

将大豆尖孢镰刀菌的DNA浓度依次稀释为9×10⁷、9×10⁶、9×10⁵、9×10⁴、9×10³、9×10²、9×10、9 fg/μL 8个模板浓度，以步骤“2.4”中筛选出的最佳引物对配制反应体系并检测灵敏度^[15]。按不同浓度制备扩增体系，ddH₂O制备阴性对照，在最优反应温度和最优反应时间条件下孵育，时间到后立即取出并加入6×loading buffer，于56 ℃孵育5 min，反应结束后进行2.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，电泳条件设定为80 V恒压，电泳时间55 min，确定ERA对大豆尖孢镰刀菌DNA的最低检测限。

用筛选出的ERA体系对大豆尖孢镰刀菌、大豆疫霉菌、大豆灰斑菌、茄腐镰刀菌、东北霜霉菌、锐顶镰孢菌、腐皮镰孢菌的DNA进行检测，设置ddH₂O为阴性对照，时间到后立即取出并加入6×loading buffer，于56 ℃孵育5 min，反应结束后进行2.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，电泳条件设定为80 V恒压，电泳时间55 min，评价该检测方法的特异性。

从田间采集自然发病的大豆尖孢镰刀菌菌丝、未感染大豆尖孢镰刀菌的大豆植株、感染尖孢镰刀菌大豆植株、感染大豆疫霉菌大豆植株、大豆灰斑菌菌丝、茄腐镰刀菌菌丝、锐顶镰孢菌菌丝样品提取DNA稀释至均一浓度，并利用ddH₂O制备阴性对照，在上述实验得到的最适反应条件下孵育，时间到后立即取出并加入6×loading buffer，于56 ℃孵育5 min，反应结束进行2.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，电泳条件设定为80 V恒压，电泳时间55 min，电泳结束后对电泳结果进行分析，用以验证此试验是否能在生产生活中得到应用。

不同提取方法对大豆尖孢镰刀菌基因组的提取结果如表 2所示。在生物学研究中，纯基因组DNA的OD_260/280比值处于1.8~1.9时，通常被视为样品DNA纯度良好的标志。该比值大于1.9，往往意味着样品可能受到了RNA或其他杂质的污染；当该比值小于1.8时，则表明样品可能存在蛋白质或酚类物质的污染情况。综合以上及数据所得，改良SDS-季铵盐法和改良SDS法提取的基因组浓度较高，但改良SDS的OD_260/230值低于2时，可能有杂质污染，因此，改良SDS-季铵盐法提取效果更好。

将不同种提取方法的DNA进行0.7 %凝胶电泳验证，不同提取方法的电泳结果如图 1所示。所有泳道均有条带，说明5种方法均能提取出尖孢镰刀菌DNA；第1、5泳道提取结果条带最明亮，说明改良CTAB法、改良SDS-季铵盐法均能获得较好浓度和纯度的DNA，但改良CTAB法存在少量DNA降解现象；第2、3、4泳道条带较暗，说明SDS法、改良SDS法、月桂酰肌氨酸钠法提取浓度低于其他方法，但也能满足后续PCR扩增。

利用已知特异性引物CYP505 PCR扩增大豆尖孢镰刀菌全基因组，进行3次重复实验并电泳验证(图 2)，显示结果与预期大小相符，送交生工上海生物工程有限公司测序并进行序列比对，与NCBI上大豆尖孢镰刀菌的同源性达到99%以上，满足设计RPA引物的需要。

由图 3可知，参与实验的6对引物，均可扩增出特异性条带。其中，泳道2、3、4、5均出现非特异性条带，泳道6比泳道7条带较暗，扩增效果不如泳道7。经多次验证，第7泳道对应引物的扩增效果更好，由此得出最适引物对为F29/R335，扩增长度为247 bp。

设置反应温度梯度为37 ℃、38 ℃、39 ℃、40 ℃、41 ℃、42 ℃。根据图 4显示，以上反应温度均可出现条带，但泳道5明显亮于其他条带，其中泳道2、3、4可能因为温度较低不能使酶反应充分，而泳道6、7可能因为温度较高而反应酶部分失活。综上，在泳道5的温度下，条带更亮，反应更充分，40 ℃为最优反应温度。

从图 5可以看出，所有泳道均出现条带，泳道2、3、4无非特异条带，其中泳道2、3条带较暗，而泳道4较于泳道2、3条带更亮，表明扩增效果更好；泳道5、6出现非特异性条带，原因可能是反应时间过长，发生了非特异性扩增。因此，最终确定最佳反应时间为20 min。

灵敏度结果如图 6，随着DNA浓度的不断降低，各泳道的亮度也在不断减弱，RPA检测方法在9×10 fg/μL的时候仍可见较浅的条带，但是到第9泳道9 fg/μL时，所拍照片肉眼观察不到条带。因此，可以得出RPA的检测限为90 fg/μL。

特异性验证结果如图 7所示，在相同扩增条件下，只能检测出第8泳道的大豆尖孢镰刀菌，而其他泳道的大豆疫霉菌、大豆灰斑菌、茄腐镰刀菌、东北霜霉菌、锐顶镰孢菌、腐皮镰孢菌均未出现目的条带，证明本试验具有较高的特异性。

试验样本验证结果如图 8所示，感染大豆疫霉菌大豆植株、大豆灰斑菌菌丝、茄腐镰刀菌菌丝、东北霜霉菌菌丝、锐顶镰孢菌菌丝均未扩增出条带，与阴性对照相同；只有第2、3泳道的感染尖孢镰刀菌大豆植株、大豆尖孢镰刀菌菌丝在实际样本验证时仍具有较强特异性。

随着大豆尖孢镰刀菌造成的减产危害愈来愈大，须及时高效地检测病害，以减少经济损失^[16]。目前的检测技术有菌落平板稀释法、常规PCR、实时定量PCR，但其中存在着实验周期长，需要大型仪器的问题，不能实现快速的现场检测。本研究应用等温扩增的ERA技术建立了针对该菌的快速检测方法，并创新应用了2.5 mol/L四正丁基溴化铵与SDS相结合的方法，提取出了较好的大豆尖孢镰刀菌的基因组。季铵盐在乙醇等有机溶剂中的溶解度也更高，因此，在相同工作浓度条件下具有更低的成本，可得到浓度和纯度较好的基因组DNA。根据NCBI上下载的大豆尖孢镰刀菌基因CYP 505的特异性区段，并运用Primer 5设计了两对正向引物和三对反向引物并进行实验筛选，确认了F29/R335为最佳引物对。通过不断地优化检测体系，与其他检测植物病虫害的体系相比：在检测灵敏度方面，本研究的检测下限可达90 fg/μL，而同样应用ERA技术仅检测到10 μg/μL的样本；在检测时间方面，本试验最优反应时间为20 min，而王春伟等^[5]则需要30 min。因此，本试验建立的反应体系具有更灵敏、更快速的优势。

综上，本研究应用ERA技术建立的针对大豆尖孢镰刀菌检测方法可以在常温40 ℃、20 min内即可显现结果，最低90 fg/μL时即可检出，具有操作快速、准确、灵敏的优势，可实现现场化的快速检测，为大豆尖孢镰刀菌的检测提供了一个新的方向，对于该病的田间检测和早期诊断有重要意义。