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烟草赤星病是一种由真菌引起的病害，其病原体为丝孢纲链格孢属的普通链格孢菌(Alternaria alternata)。该病常发生于烟叶成熟期，主要表现为典型的叶斑症状。病原菌生长迅速、适应性强，近年来已成为继病毒病之后，对烟叶产量和品质影响最为严重的病害之一，严重制约了农民经济效益[1]。烟草赤星病最早于1892年在美国烟草上被发现，每年发病面积约10万hm2，显著降低烟叶质量，造成数亿元经济损失[2]，对全球烟草产业构成严重威胁。
目前，针对烟草赤星病的防治策略普遍强调“预防为主”，主要依靠选用抗性较强的烟草品种，并结合化学农药进行控制[3]。现有防治措施仍以化学药剂为主(如菌核净、丙环唑等)，这些药剂对病原菌具有较好的抑制效果。然而，长期依赖化学药剂存在明显弊端，不仅易导致病原菌产生抗药性，还会造成土壤和水体污染，对生态环境及人体健康带来不良影响。相比之下，生物防治主要依靠拮抗性微生物及其代谢产物(如木霉菌、芽孢杆菌及其产生的抗菌物质)来抑制病原菌，具有安全、环保、无残留等优点，不会造成环境污染，并能有效延缓病原菌抗药性的发展。近年来，生物防治在烟草病害防控中的研究逐渐增多，主要通过筛选来源于土壤或烟草内生的有益微生物加以利用，国内外相关研究均已取得初步进展[4-8]。例如，陈娜等[9]筛选并鉴定出一株对烟草赤星病具有生防效果的多粘类芽孢杆菌，其胞内粗提物可显著抑制黑胫病菌的菌丝生长和孢子萌发；田琳等[10]筛选的生防菌株XNB-02对烟草赤星病菌表现出较强拮抗作用，抑菌圈半径可达10.33 mm；叶爱萍等[11]则从蚯蚓粪中筛选到一株副地衣芽孢杆菌，其初筛和复筛的抑菌率均超过60%，对孢子萌发和菌丝生长的抑制率分别为73.33%和79.68%。因此，从健康烟株根际土壤中筛选拮抗菌，寻找兼具绿色防控和环境友好特性的生防菌株具有重要意义[12-14]。本研究从四川省攀枝花市土壤样品中分离并筛选获得1株具有生防潜力的菌株，测定其对烟草赤星病菌的抑制作用。通过形态学观察、生理生化特性分析及分子生物学鉴定，确认该菌株为贝莱斯芽孢杆菌。进一步探讨了该菌株对烟草赤星病的抑菌机理、室内防效及促生作用，并检测其发酵液的稳定性。研究结果可为生防菌剂的开发提供新的菌种资源。
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烟草赤星病菌(Alternaria alternata)在使用前置于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上活化培养7 d。另选取9种病原真菌，包括小麦茎基腐病菌(Fusarium pseudograminearum)、小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、梨腐烂病菌(Valsa ambiens)、黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、辣椒疫病菌(Phytophthora capsici Leonian)、马铃薯早疫病菌(Alternaria solani)、烟草根黑腐病菌(Thielaviopsis basicola)、番茄早疫病菌(A. solani)和苹果炭疽病菌(Glomerella cingulata)。所有病原真菌均保存于西北农林科技大学植物病毒与资源微生物实验室。
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供试土壤采自四川省攀枝花市长期实行轮作的健康烟田，共随机采集烟株根际土壤20份。
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PDA培养基的配方为葡萄糖20 g、土豆200 g、琼脂15~20 g、蒸馏水1 000 mL，pH值维持自然。革兰氏染色所用试剂包括番红染色液、结晶紫染色液、95%乙醇溶液和碘液。LB液体培养基按常规配方制备，固体培养基在此基础上加入琼脂15~20 g。PVK培养基用于溶磷能力检测，其成分为MnSO4 1.0 g、(NH4)2SO4 0.5 g、葡萄糖10.0 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、KCl 0.3 g、琼脂粉15.0~20.0 g、Ca3(PO4)2 5.0 g、NaCl 0.3 g、FeSO4 0.3 g、蒸馏水1 000 mL。
钾长石培养基用于解钾能力检测，配方为CaCO3 0.1 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、钾长石粉1.0 g、蔗糖5 g、琼脂粉15.0~20.0 g、Na2HPO4 2.0 g、FeCl3 0.05 g、蒸馏水1 000 mL。CMC培养基用于纤维素酶产量检测，成分为KNO3 1.0 g、羧甲基纤维素20.0 g、琼脂粉15.0~20.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、NaCl 0.5 g、K2HPO4 0.5 g、蒸馏水1 000 mL。纳氏试剂分为两部分，a液为KOH 15 g溶于蒸馏水50 mL，b液为KI 5 g和HgCl2 2.5 g溶于蒸馏水10 mL，使用时混合。
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实验中使用甲基红试剂、卢戈氏碘液和石蕊试剂。
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供试植物为烟草品种K326，6~8叶期。同时选用的烟草种子包括K326、延安1号、中烟特香301、云烟119、云烟87和豫烟12号。
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从每份待检测土壤样品中取10 g，加入90 mL无菌水中混匀后，置于60 ℃恒温水浴锅中煮30 min，静置10 min。取上清液依次稀释，制备10-2至10-8梯度稀释液。吸取0.1 mL稀释液涂布于LB平板，在28 ℃培养箱中倒置培养3 d。挑选不同形态的单菌落进行多次纯化，直至菌落在形态、颜色及大小上保持一致。将纯化后的菌株接种于LB斜面培养基，在适宜条件下培养3 d后，置于4 ℃冰箱保存。
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采用对峙培养法筛选拮抗菌株[15]。以烟草赤星病菌为指示菌，将病菌菌饼接种于PDA平板中央，再将分离得到的细菌菌株接种于距病原菌等距的十字交叉四端。置于28 ℃恒温培养箱中培养5 d后，测量抑菌带宽度，并择优选取抑菌带最大的菌株。每组实验设置3个重复。
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在30 ℃条件下于LB培养基中培养菌株CX-2，采用扫描电子显微镜观察其菌落形态，并在光学显微镜下通过革兰氏染色和芽孢染色进行细胞形态观察。利用MIDI系统分析菌株CX-2的脂肪酸组成，并通过API 50CH试剂条进行进一步鉴定。
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采用细菌16S rRNA基因通用引物27F和1492R扩增16S rRNA基因。PCR反应体系与反应条件参照相关文献[16]。扩增产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。所得序列利用NCBI数据库的BLAST程序进行同源性比对，并使用MEGA 7.0软件采用邻接法(Neighbor-Joining，NJ)构建系统发育树。
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采用平板对峙法进行抑菌试验。将烟草赤星病菌菌饼接种于PDA平板中央，再将菌株CX-2等距接种于菌饼周围4个方向(距离3 cm)。平板置于28 ℃培养箱中培养5 d后测量抑菌带宽度，每组设3个重复。抑菌率的计算公式如下[17]：
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依据以下标准设定基础发酵条件：接种比例为1%，培养液初始pH值设为7.0，培养温度为28 ℃，液体装液量与三角瓶体积比为2∶5(即在250 mL三角瓶中加入100 mL培养液)，摇床转速设为150 rpm，培养时间为2 d。为优化各参数，分别设置如下梯度：初始pH值设为4、5、6、7、8、9六个水平；装液量设为25、50、75、100、125、150 mL六个水平；温度设为24、26、28、30、32、34 ℃六个水平；接种比例设为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%六个水平。每个处理均设置3个重复。
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CX-2菌株在28 ℃恒温条件下培养2 d后，利用接种环分别点接于溶磷(PVK)培养基和钾长石培养基中央，置于28 ℃培养箱中避光培养4 d，观察并记录透明圈的形成情况[18]。固氮能力的检测采用纳氏试剂法：使用接种环将CX-2接种于蛋白胨无氮液体培养基中，振荡培养3 d后向其中加入5 mL纳氏试剂，以未接种的蛋白胨无氮培养基为空白对照。在常温条件下，纳氏试剂呈淡黄绿色；反应液在试管架中静置1 h后，观察并记录碘离子和汞离子与液体中氨反应所形成的红棕色或黄色络合物生成情况[19]。
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CX-2菌株的酶活性与代谢产物产生情况通过多种方法进行检测。产纤维素酶的测定中，将在28 ℃恒温条件下培养2 d的CX-2菌体用接种环点接于羧甲基纤维素(CMC)培养基中央，在28 ℃恒温培养箱内避光培养，每组设3个重复。培养4 d后，用碘液染色10 min，再用5% NaCl溶液及无菌水反复冲洗，观察透明圈的产生情况。产蛋白酶的测定中，将同样培养2 d的CX-2菌体直接点接于酵素(YMA)培养基中央，每组设3个重复，并在28 ℃恒温培养箱内避光培养4 d。随后使用1%刚果红溶液染色10 min，并用无菌水冲洗，观察透明圈形成情况[19]。产嗜铁素的检测中，将CX-2接种于嗜铁素培养基，在30 ℃条件下培养5 d，每组设3个重复；若在培养基上出现明显降解圈，则表明该菌株具有产生嗜铁素的能力[18]。
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挑选生长势相近的5叶期烟苗30株，移栽至大盆中培养，并在常规条件下培育7 d至其生长稳定。制备含菌量为1×108 CFU/mL的发酵液，每盆灌根处理300 mL，每7 d处理1次，期间正常浇水。同时，设置10株正常培养、不进行菌液处理的烟株作为对照。在移栽后70 d采收烟株，测定各株茎围和株高，去除根际附着土壤后称量植株鲜重，再将样品置于60 ℃烘箱中干燥72 h，最后测定植株干重。
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设置清水对照组、接菌对照组、菌株发酵液保护效果处理组、菌株发酵液治疗效果处理组、50%多菌灵保护效果处理组及50%多菌灵治疗效果处理组共6个处理。清水对照组不接种发酵液，仅以清水正常浇灌。接菌对照组移苗7 d后，每盆灌根100 mL、菌数为1×108 CFU/mL的烟草赤星病菌悬液。菌株发酵液保护效果处理组移苗7 d后，每盆灌根200 mL、菌数为1×108 CFU/mL的菌株CX-2发酵液，待2 d后再接种与接菌对照组相同条件的病菌悬液。菌株发酵液治疗效果处理组缓苗7 d后，先灌根100 mL、浓度为1×108 CFU/mL的病菌悬液，再于2 d后接种200 mL、菌数为1×108 CFU/mL的菌株CX-2发酵液。50%多菌灵保护效果处理组在烟株茎基部喷施稀释500倍的50%多菌灵，2 d后再灌根100 mL病菌悬液。50%多菌灵治疗效果处理组在缓苗7 d后，先灌根100 mL病菌悬液，再于2 d后在烟株茎基部喷施稀释500倍的50%多菌灵。每个处理均设5盆重复，置于温室条件下培养，15 d后调查烟苗发病情况，并计算发病率和病情指数。为客观评价不同处理的防治效果，在盆栽试验之后对烟株病害进行分级，病害分级标准见表 1。统计烟草赤星病的发病率，并按照公式(2)(3)计算病情指数和相对防效。
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试验数据包括抑菌率、透明圈直径、植株生长指标(茎围、株高、鲜重和干重)以及病情指数和相对防效等参数。所有数据均采用Excel 2016进行整理和初步统计，并使用SPSS 19.0软件进行方差分析(ANOVA)。各处理间差异通过Duncan多重比较法进行检验，显著性水平设定为p < 0.05。
1.1. 供试材料
1.1.1. 供试病原真菌
1.1.2. 生防细菌土壤筛选
1.1.3. 供试培养基
1.1.4. 供试试剂
1.1.5. 供试植物
1.2. 试验方法
1.2.1. 拮抗菌分离
1.2.2. 拮抗菌筛选
1.2.3. 拮抗菌鉴定
1.2.3.1. 形态学及生理生化特征鉴定
1.2.3.2. 分子生物学鉴定
1.2.4. 菌株CX-2的抑菌谱测定
1.2.5. 菌株CX-2发酵条件优化
1.2.6. 菌株CX-2次生代谢产物分析
1.2.6.1. 溶磷、解钾及固氮能力
1.2.6.2. 抑菌相关水解酶
1.2.7. 菌株CX-2盆栽防效测定
1.2.7.1. 促生试验
1.2.7.2. 室内盆栽防治效果
1.3. 数据统计与统计学分析
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从20份根际土样中共分离纯化253株细菌。通过对峙试验筛选出9株具有明显抑菌活性的菌株，菌株拮抗效果如图 1所示。其中，CX-2的抑菌带最大，达17.23 mm(表 2)，CX-2对烟草赤星病菌的抑制表现见图 2。
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CX-2菌株革兰氏染色结果为阳性，细胞呈杆状，能形成芽孢。菌落边缘不规则，表面呈白色且具有粘稠性(图 3)。
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采用MIDI技术对CX-2菌株进行脂肪酸分析，结果显示其主要脂肪酸C15：0 anteiso、C15：0 iso、C16：0，分别为44.44%、16.11%、12.51%(表 3)。此外，API 50CH检测结果表明，该菌株对纤维二糖、蔗糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、甘露醇、淀粉、糖原、麦芽糖、α籽甲基-D-葡萄糖甙、山梨醇和七叶灵呈阳性反应，对甘油、L-阿拉伯糖、核糖、D-木糖、肌醇、柳醇、乳糖、拢牛儿糖、海藻糖、棉籽糖、N-乙酰-葡糖胺、苦杏仁甙和熊果甙呈弱阳性反应(表 4)。综合分析，这些生理生化特征与贝莱斯芽孢杆菌的特性一致。
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克隆并测序获得菌株CX-2的16S rRNA基因片段，长度为1 453 bp。该基因序列已提交至GenBank数据库，登录号为PQ813645。通过EzBioCloud网站(
http://www.ezbiocloud.net/eztaxon/ )将CX-2的16S rRNA序列与已知模式菌株进行比对，结果显示CX-2与PQ459431.1 Bacillus velezensis的序列相似度最高(图 4)。
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通过对10种常见经济作物病害病原菌进行对峙试验，菌株CX-2显示出良好的广谱抑菌活性。其中，针对玉米大斑病菌、小麦赤霉病菌和苹果炭疽病菌的抑菌率均超过90%；此外，对番茄早疫病菌、马铃薯早疫病原菌和小麦茎基腐的抑菌率均超过70%。具体见图 5和表 5。
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通过对菌株CX-2在不同发酵条件(如培养温度、初始pH值、装液量及接种量等)的单因素优化，得到了最佳发酵条件。当培养pH值为最佳值6时，吸光值(OD600)达到峰值，OD600值为2.201；在其他条件不变的情况下，当接种量为1.0%时，OD600达到峰值，其值为2.226；在其他条件不变的情况下，当培养温度设定为30 ℃时，OD600达到峰值，其值为2.314；在其他条件不变的情况下，当装液量为75 mL时，OD600为2.224(图 6)。
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在不同培养基中培养96 h后，菌株CX-2均能产生透明降解圈(图 7)。分析结果表明，菌株CX-2表现出较强的纤维素酶活性、蛋白酶产量、固氮能力和溶磷能力。在CMC培养基中，菌株CX-2形成直径54.3 mm的透明圈；在YMA培养基中，透明圈直径为22.7 mm；在纳氏试剂中，形成明显的红棕色络合物。菌株的解钾能力较弱。
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在温室中培养70 d后，将处理组和对照组的烟株采出，分别对株高、茎围、烟叶鲜重、烟叶干重、根系湿重和根系干重进行比较。由表 6可见，CX-2发酵液处理组的烟株在各项农艺性状上均表现出显著的提升，整体长势优于对照组，烟叶面积较大，根茎部健康发达(图 8)。与对照组相比，地上部分鲜重和干重分别增加了67.71% 和84.92%，根系鲜重增加了74.59%。
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室内盆栽试验结果如表 7所示，CX-2菌株发酵液和50%多菌灵处理后的烟株发病率和病情指数较接菌对照相比均显著降低。CX-2菌株发酵液在预防烟草赤星病方面的效果与杀菌剂50%多菌灵相当，但在治疗效果上，50%多菌灵优于菌株发酵液。该结果表明，CX-2菌株发酵液对烟草赤星病具有较好的防治效果。
2.1. 烟草赤星病拮抗菌株的分离与筛选
2.2. 烟草赤星病拮抗菌CX-2的鉴定
2.2.1. 形态学鉴定
2.2.2. 生理生化鉴定
2.2.3. 分子生物学鉴定
2.3. 菌株CX-2抑菌谱测定
2.4. 菌株CX-2发酵条件优化
2.5. 菌株CX-2次生代谢产物分析
2.6. 菌株CX-2盆栽促生效果
2.7. 菌株CX-2的室内盆栽防治效果
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生防菌因其环保、低毒性及对非目标生物影响小等特点，已成为农业中重要的绿色防控手段。通过分离和筛选优质生防菌株，可以丰富烟草的生防资源。在常见的生防菌中，枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、木霉菌和淡紫拟青霉等已广泛应用于农作物病害防治和土壤健康管理[20]。本研究从根际土壤中分离得到了一株具有显著拮抗作用的菌株CX-2，经形态学、生理生化及分子鉴定，确认其为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。
贝莱斯芽孢杆菌作为一种常用的生防菌，广泛分布于植物根际土壤中，具有良好的环境适应性，能够有效定殖在植物根部，形成保护屏障，从而减轻病害的发生，并显著促进植物的生长[21]。已有研究报道了贝莱斯芽孢杆菌在植物病害防治中的应用。Xia等[22]的研究表明，芽孢杆菌是抗性玉米品种的核心微生物群，可以诱导宿主对玉米茎腐病的代谢防御；王玉鹏等[23]分离鉴定出一株贝莱斯芽孢杆菌G18，能够显著促进枸杞的生长，并增强其对根腐病的抗性；周池等[24]的研究表明，辣椒内生菌贝莱斯芽孢杆菌XY40-1对辣椒疫病具有良好的生防效果，同时具备促生作用，具有成为防治辣椒病害的多功能优质菌株的潜力；王文肖等[25]将贝莱斯芽孢杆菌EA19与化学药剂复配，发现贝莱斯芽孢杆菌EA19与多菌灵在小麦赤霉病防治中具有协同效果，二者复配可减少多菌灵的使用量。本研究筛选出的菌株CX-2同样表现出广泛的抑菌活性和极强的生物活性，温室促生试验证实了CX-2发酵液对烟株各农艺性状的显著提升效果，室内盆栽防效试验则明确了CX-2在烟草赤星病防治中的应用前景。CX-2对烟草赤星病的防治效果近70%，CX-2菌株的成功应用表明，它可以显著抑制链格孢属真菌的生长，从而降低烟草赤星病的发病率，验证了CX-2作为生防菌株的可行性，为其在病害防治体系中的应用提供了重要依据。
由于贝莱斯芽孢杆菌在生长过程中能够产生多种活性物质和芽孢，因此筛选和优化其发酵培养条件显得尤为重要[26-27]。菌株CX-2的发酵过程受到多种因素(如发酵设备、工艺和技术等)的影响。本研究对菌株CX-2的发酵工艺进行了优化，确定其最适pH值为6、最适接种量为1.0%、最适培养温度为30 ℃、最适装液量为75 mL，以提高发酵效率和产孢量。下一步可进一步优化CX-2在环境应激条件下(如高温、干燥)的抗逆性，以增强其在多种农业生态环境中的适应能力。
本研究虽对菌株CX-2的生防能力进行了初步评估，但其关键抑菌活性物质尚未明确。此外，未来可进一步探索CX-2与土壤中其他微生物的相互作用，研究其在复杂微生态环境中的表现；还可以研究CX-2与其他生物防治剂(如木霉菌、苏云金芽孢杆菌)的协同效应，以提升整体防病效果。
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