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核盘菌几丁质酶基因家族分析与表达特性研究

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杜娇, 王娅波, 肖继芬, 等. 核盘菌几丁质酶基因家族分析与表达特性研究[J]. 西南大学学报（自然科学版）, 2019, 41(1): 39-45. doi: 10.13718/j.cnki.xdzk.2019.01.006
引用本文: 杜娇, 王娅波, 肖继芬, 等. 核盘菌几丁质酶基因家族分析与表达特性研究[J]. 西南大学学报（自然科学版）, 2019, 41(1): 39-45. doi: 10.13718/j.cnki.xdzk.2019.01.006
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Jiao DU, Ya-bo WANG, Ji-fen XIAO, et al. Characterization and Expression Analysis of Chitinase Family Genes in Sclerotinia sclerotiorum[J]. Journal of Southwest University Natural Science Edition, 2019, 41(1): 39-45. doi: 10.13718/j.cnki.xdzk.2019.01.006
Citation: Jiao DU, Ya-bo WANG, Ji-fen XIAO, et al. Characterization and Expression Analysis of Chitinase Family Genes in Sclerotinia sclerotiorum[J]. Journal of Southwest University Natural Science Edition, 2019, 41(1): 39-45. doi: 10.13718/j.cnki.xdzk.2019.01.006
shu

核盘菌几丁质酶基因家族分析与表达特性研究

  • 1.

    西南大学 植物保护学院, 重庆 400715

  • 2.

    凉山民族师范学校, 四川 西昌 615000

  • 基金项目: 重庆市基础与前沿研究一般项目（cstc2017jcyjAX0096）；中央高校基本科研业务费“创新团队”专项（XDJK2017A006）
详细信息
    作者简介:

    杜娇(1992-), 女, 硕士研究生, 主要从事分子植物病理学研究 .

    通讯作者: 余洋, 副教授

  • 中图分类号: S432.4+4

Characterization and Expression Analysis of Chitinase Family Genes in Sclerotinia sclerotiorum

  • 1.

    School of Plant Protection, Southwest University, Chongqing 400715, China

  • 2.

    Liangshan National Normal School, Xichang Sichuan 615000, China

摘要

  • 摘要: 核盘菌菌核以子实体形式萌发是作物菌核病病害循环中关键性的一环，研究菌核子实体萌发分子机理将为菌核病的安全控制提供线索.该研究通过生物信息学方法对核盘菌几丁质酶基因家族进行分析，并利用实时荧光RT-PCR对其在菌核子实体萌发阶段的表达进行探讨.生物信息学分析表明核盘菌中共有12个基因编码假定的几丁质酶，它们均具有GH18结构域，部分蛋白还具有几丁质结合结构域和纤维素结构域；除SS1G_11212外其余蛋白均为亲水性蛋白；亚细胞定位预测表明其中10个假定几丁质酶位于胞外，其余2个分别位于细胞核和细胞质中.通过构建系统发育树分析发现假定几丁质酶可以分为2大类，其中3个与酵母几丁质酶CTS1归为一类，其余9个与CTS2归为另一类.除SS1G_00773外，其余11个几丁质酶基因在核盘菌菌核子实体萌发过程中表达量均有变化，推测几丁质酶家族蛋白可能参与核盘菌菌核子实体萌发过程.
    Abstract: The carpogenic germination of sclerotia for Sclerotinia sclerotiorum is a key step of crop sclerotiniose infection cycle. Studying the molecular mechanism involved in the carpogenic germination of scleortia will provide clues to control the sclerotiniose safely. In this study, chitinase family proteins of S. sclerotiorum were analyzed with the bioinformation approach, and the expression levels of chitinase genes during the carpogenic germination of sclerotia were determined with RT-PCR method. Bioinformatics analysis showed that 12 genes were predicted to encode chitinase in S. sclerotiorum. All of them had GH18 domains and some also had a chitin-binding domain and a cellulose-binding domain. All the chitinases were hydrophilic except SS1G_11212. Ten chitinases were predicted to be located outside the cell, and the others were located in the nucleus cytoplasm. Phylogenetic tree analysis showed that the 12 chitinases could be divided into two categories, of which 3 with yeast chitinase CTS1 were clustered together and the rest with CTS2 were clustered together. The expression level of the 11 chitinase genes changed during the carpogenic germination of sclerotia, except SS1G_00773, suggesting that chitinase family proteins are involved in the carpogenic germination of sclerotia for S. sclerotiorum.

  • 核盘菌[Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary]是一种世界性分布的重要植物病原真菌，寄主范围十分广泛，能侵染75科278属450多种植物[1]，由它引起的作物菌核病每年都造成巨大的经济损失[2-3].由于缺乏高抗的种植品种，到目前为止对菌核病的防治仍以化学防治为主[4-7].长期使用化学农药已导致田间核盘菌菌株出现严重的抗药性，开发新的防治方法迫在眉睫.

    核盘菌能在寄主上产生坚硬、黑色的菌核，菌核以子实体形式萌发并释放的子囊孢子是作物菌核病的重要初侵染来源[2].为有效抵抗外界不良环境，菌核中的细胞壁外围绕着较厚的碳水化合物层.菌核萌发过程中需要分泌多种多糖水解酶来降解细胞壁，使得子囊柄原基穿透菌核，但到目前为止在其中起关键性作用的水解酶及其功能仍不清楚.研究表明菌核加厚的细胞壁主要由β-葡聚糖、几丁质以及其他多种未知多糖共同组成[8-9].几丁质是由N-乙酰-D-氨基葡萄糖以β-1，4糖苷键连接而成的长链多聚物[10].几丁质酶可将几丁质水解为几丁寡糖和N-乙酰-D-氨基葡萄糖单体[11]，在动物、植物、微生物中均有分布[12-19].研究核盘菌几丁质酶的功能将为揭示核盘菌菌核的子实体萌发机制提供线索，也为开发新的安全的菌核病防治措施奠定基础.

    自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的几丁质酶基因CTS1和CTS2被克隆之后[20-21]，随着越来越多的丝状真菌基因组测序完成，许多真菌几丁质酶基因家族已被鉴定并进行了分析[22-23].丝状真菌基因组中一般含有10~25个几丁质酶，且都属于糖基水解酶18家族[24].韩艺娟等[25]对稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)假定几丁质酶家族基因表达进行分析，指出几丁质酶家族蛋白可能参与稻瘟病菌的生长发育、形态建成和致病过程.部分几丁质酶基因功能已经通过基因敲除等方法进行了深入研究[26]. Takaya等[27]破坏构巢曲霉(Aspergillus nidulans)中几丁质酶基因chiA，发现菌丝生长和分生孢子形态没有发生变化，但是分生孢子的萌发率和菌丝的生长速率明显降低. Yamazaki等[28]敲除构巢曲霉几丁质酶基因chiB，发现该基因缺失对菌丝的生长速率没有影响，却降低了细胞内外几丁质酶活性影响了菌丝的自溶.李培[29]通过RNAi稻瘟病菌几丁质酶基因的表达，发现菌丝生长和孢子分化出现异常. Dünkler等[30]敲除棉病囊霉(Ashbya gossypii)中几丁质酶基因AgCts2后，发现该基因缺失不会影响菌丝的生长及形态建成，但会形成异常的子囊孢子.这些研究表明几丁质酶在丝状真菌的生长发育过程中起着重要作用.

    迄今为止，对于核盘菌菌核子实体萌发过程中起关键性作用的几丁质酶及其功能仍不清楚.本研究拟通过生物信息学方法深入分析核盘菌几丁质酶基因家族的特性，并利用实时荧光RT-PCR方法对其在菌核子实体萌发过程中的表达模式进行探讨，研究结果将为深入揭示几丁质酶基因在核盘菌生长发育中的作用奠定基础，也为菌核病的安全防治机制提供线索.

    1.   材料与方法

    1.1   材料

    1.1.1   菌株

    核盘菌野生型菌株1980于4 ℃条件下保存. PDA培养基用于培养核盘菌菌株；胡萝卜培养基用于培养核盘菌菌核.

    1.1.1   主要试剂

    TRIzol试剂购于上海华舜生物工程有限公司；DNase购于大连宝生物工程有限公司；ReventAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒购于MBI Fermentas公司；2×SYBR Green Realtime PCR Master Mix购于东洋纺生物科技有限公司；其他试剂为国产分析纯.

    1.2   方法

    1.2.1   核盘菌假定几丁质酶氨基酸序列的获取及其生物信息学分析

    在核盘菌基因组数据库(http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/Scleraotinia_sclerotiorum/GenomesIndex.html)中直接检索获得糖苷水解酶18家族12个成员的氨基酸序列，并用于后续相关生物信息学分析.在线软件SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-2.0/)进行信号肽预测，ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/)预测蛋白相对分子质量、等电点(PI)及疏水性(GRAVY)，ProtComp 9.0进行蛋白定位，Motif Scan(http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan)与Prosite(http://prosite.expasy.org/prosite.html)预测蛋白结构域，MEGA(Molecular Evolutionary Genetics Analysis)4.0构建蛋白的系统发育树.

    1.2.2   核盘菌菌核子实体萌发的诱导

    将核盘菌1980菌株于胡萝卜培养基中20 ℃下培养1个月后收集菌核.菌核于5%次氯酸钠溶液中消毒后用无菌水漂洗3次洗净.将菌核半埋于灭菌的湿润河沙中，16 ℃条件下直到其萌发形成初始子囊柄.

    1.2.3   核盘菌假定几丁质酶基因表达分析

    用TRIzol试剂按说明书分别提取和萌发形成子囊柄的菌核总RNA，并用DNAse处理总RNA.用ReventAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒合成cDNA第一链.以合成的cDNA为模板，进行RT-PCR扩增，使用仪器为CFX96TM Realtime System (Bio-Rad，Hercules，CA，USA).反应体系为2×SYBR Green Real time PCR Master Mix：10 μL，正/反向引物各0.2 μmol/L，cDNA模板：40 ng，总体积：20 μL.反应程序为95 ℃，2 min (1 cycle)；95 ℃ 20 sec，56 ℃ 15 sec，72 ℃ 20 sec (40 cycles).荧光读数设在56 ℃.以核盘菌Beta-tubulin基因(tub1，SS1G_04652)为内参进行基因表达分析，实验重复3次，利用Excel软件进行数据统计分析. RT-PCR引物(表 1)由生工生物工程股份有限公司合成.

    表 1  RT-PCR所用引物
    基因编号 引物序列(5′→3′)
    SS1G_11212 ACCGTATCCCTCAACCCTAATG
    ATTGATCGCATCGAGAAATCC
    SS1G_00677 TTTGATACCACAGCCGTCCC
    CGAACTAAGCCAGCCCTCTAC
    SS1G_03420 CACTGTCGCTCTTCGTCTGA
    GGTATTCGGGTCTCGTGCT
    SS1G_05897 ATGCAAATGCCCGTTGATG
    CCGACTTTCCGAAATGGTCT
    SS1G_08020 CGCTCATCAAGCAAACCTATC
    AGAAGCCCATGTTCCCTGTC
    SS1G_08695 CATCATTCCCATCGCTTTCTT
    CGGCAGTAGTGGCTTCATCAG
    SS1G_11304 GGTGGCTGGACCTATTCATCT
    CCGTGCTTCATCGGTGTTT
    SS1G_11700 CTTGAAGGCTATTCGCTCTGC
    GGTGTTATCCCAGGACCCAGA
    SS1G_00773 ACGCTGATTTGATGAGATTGC
    TTTCCTCCAAGTTTCTTCCCT
    SS1G_05454 AAATGACGATGGGTTTGGGT
    TCAGCGTGTCGCATGTATGA
    SS1G_12510 GCAGCAAACACTGGTGGACA
    CTTGGAAGGGAGAAATGAGCC
    SS1G_13155 GCTGAGGGAGTTTCTGTTTCG
    TAGATTGTCTCGGTGGTTACGG
    Beta-tubulin GTGAGGCTGAGGGCTGTGA
    CCTTTGGCGATGGGACG
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    2.   结果与分析

    2.1   核盘菌几丁质酶家族分析

    核盘菌中共12个假定的几丁质酶蛋白，分别为SS1G_11212，SS1G_00677，SS1G_03420，SS1G_05897，SS1G_11304，SS1G_11700，SS1G_00773，SS1G_05454，SS1G_08020，SS1G_12510，SS1G_13155和SS1G_08695.几丁质酶蛋白相对分子质量在3.4×104~1.9×105之间.等电点(PI)值位于4.49~8.29之间.除SS1G_11212为疏水性蛋白外(GRAVY值为0.117)，其余蛋白均为亲水性蛋白(GRAVY值为负数).利用SignalP 4.1进行信号肽预测分析发现，其中6个假定的几丁质酶(SS1G_00773，SS1G_00677，SS1G_03420，SS1G_05454，SS1G_11700，SS1G_08695)在N端具有典型的信号肽结构，信号肽的平均长度为19.3.利用ProtComp 9.0对假定的几丁质酶进行蛋白定位预测，结果表明具有信号肽的假定几丁质酶均位于胞外.在另外6个假定的几丁质酶中，SS1G_05897，SS1G_08020，SS1G_11304和SS1G_11212位于胞外，SS1G_13155定位于细胞核，SS1G_12510位于细胞质中(表 2).对假定的几丁质酶进行蛋白结构分析，结果表明12个蛋白均含有糖苷水解酶18(Glyco_18)催化结构域.此外，SS1G_00677，SS1G_00773，SS1G_05454和SS1G_12510蛋白还具有几丁质结合结构域(Chitin-binding domain，ChtBD). SS1G_11212和SS1G_08695蛋白中具有纤维素结合结构域(Cellulose-binding domain，CBM)(图 1).

    表 2  核盘菌假定几丁质酶家族蛋白性质分析
    基因编号 编码蛋白 相对分子质量 PI 信号肽 信号肽长度 蛋白定位 结构域
    SS1G_11212 ChitinaseⅡ 6.9×104 4.97 无 - 胞外 Glyco_18，CBM
    SS1G_00677 ChitinaseⅡ 5.2×104 4.90 有 19 分泌到胞外 Glyco_18，ChtBD
    SS1G_03420 ChitinaseⅡ 3.5×104 4.80 有 15 分泌到胞外 Glyco_18
    SS1G_05897 ChitinaseⅡ 3.4×104 6.09 无 - 胞外 Glyco_18
    SS1G_08020 ChitinaseⅡ 7.5×104 8.29 无 - 胞外 Glyco_18
    SS1G_08695 Chitinase Ⅲ 4.4×104 5.70 有 22 分泌到胞外 Glyco_18，CBM
    SS1G_11304 ChitinaseⅡ 4.4×104 4.94 无 - 胞外 Glyco_18
    SS1G_11700 ChitinaseⅡ 4.8×104 6.49 有 23 分泌到胞外 Glyco_18
    SS1G_00773 ChitinaseⅡ 1.9×105 4.79 有 18 分泌到胞外 Glyco_18，ChtBD
    SS1G_05454 ChitinaseⅡ 1.9×105 4.95 有 19 分泌到胞外 Glyco_18，ChtBD
    SS1G_12510 ChitinaseⅡ 1.2×105 5.95 无 - 胞质 Glyco_18，ChtBD
    SS1G_13155 ChitinaseⅡ 1.2×105 4.49 无 - 胞核 Glyco_18
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    图 1  核盘菌假定几丁质酶家族蛋白功能域分析
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    2.2   核盘菌几丁质酶家族系统发育关系分析

    图 2中12个假定几丁质酶蛋白可以分为2大类，SS1G_13155，SS1G_08695和SS1G_11212聚为一类，与CTS1同源性较高. SS1G_00677等9个假定几丁质酶聚为一类，与CTS2同源性较高.这9个假定几丁质酶可以分为3个亚类：第1亚类包含SS1G_08020，SS1G_11304，SS1G_11700和SS1G_05897，该亚类中的蛋白与CTS2同源性最高；第2亚类包含SS1G_00677，SS1G_05454，SS1G_00773和SS1G_12510；第3亚类仅有SS1G_03420蛋白.

    图 2  核盘菌假定几丁质酶家族系统发育关系
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    2.3   核盘菌假定几丁质酶基因的表达

    为研究几丁质酶家族基因在核盘菌中的作用，通过实时荧光RT-PCR方法检测了它们在核盘菌菌丝生长及菌核发育各阶段的表达量(图 3). SS1G_00677，SS1G_03420，SS1G_05897，SS1G_08020，SS1G_05454和SS1G_12510基因在菌核子实体萌发阶段表达量升高，而SS1G_11212，SS1G_08695，SS1G_11304，SS1G_11700和SS1G_13155基因在菌核子实体萌发阶段表达量下降.此外，SS1G_00773基因在核盘菌菌核子实体萌发阶段表达量几乎无变化.

    图 3  核盘菌菌核子实体萌发阶段各几丁质酶基因的表达
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    3.   结论

    本研究发现核盘菌几丁质酶家族共有12个成员，有6个假定几丁质酶(SS1G_03420，SS1G_05897，SS1G_08020，SS1G_11700，SS1G_00773和SS1G_13155)属于A亚组，它们仅含有一个催化区，没有几丁质或纤维素结合域.这6个假定几丁质酶除SS1G_13155外，均定位于胞外，推测这些蛋白的主要作用区在细胞外. B亚组除含有催化区外，还含有一个纤维素结合域，在核盘菌中共有2个假定几丁质酶归属于B亚组，包括SS1G_11212和SS1G_08695，它们具有富含丝氨酸/苏氨酸结构域(Serine/threonine rich domains)，推测这2个蛋白成熟后可能结合细胞膜发挥作用.剩余的4个假定几丁质酶属于C亚组，它们蛋白相对分子质量较大，除含有一个催化区外，在靠近N端还含有1~2个几丁质结合域，该结合域能够有效地增强几丁质酶对几丁质底物的亲和性，提高酶的活性[31].

    系统发育树分析表明核盘菌12个假定几丁质酶中有3个与酵母几丁质酶CTS1聚为一类，主要包括B亚组的2个蛋白和A亚组的SS1G_13155，其中CTS1与B亚组蛋白同源性最高.研究表明CTS1与酵母细胞相互分离相关，CTS1基因缺失突变体细胞分离不完全，形成大量假菌丝[32-33].构巢曲霉B亚组几丁质酶CHIA与细胞壁重塑密切相关[27]. SS1G_11212和SS1G_08695在核盘菌中的功能还不清楚，推测有可能在菌核子实体萌发细胞壁重塑中起着重要作用.另外9个假定几丁质酶与CTS2聚为一类，主要包括A亚组和C亚组蛋白，其中A亚组与CTS2同源性最高.酵母CTS2基因敲除突变体与野生型菌株没有差别，但棉病囊霉CTS2蛋白编码基因AgCts2被破坏后突变体形成异常的子囊孢子[30].与棉病囊霉相比，核盘菌通过菌核子实体萌发形成子囊孢子的过程更加复杂，A亚组几丁质酶在该过程中的作用有待于进一步研究.

    本研究对几丁质酶基因在菌核子实体萌发阶段的表达进行了分析，结果显示11个基因在菌核子实体萌发前后表达量都出现了变化，推测几丁质酶参与了核盘菌的菌核子实体萌发过程.其中6个基因在菌核子实体萌发阶段上调表达，它们分布于A亚组和C亚组，预示这2个亚组在菌核子实体萌发中所起的作用.下一步需要通过对单个基因分别进行敲除或者沉默，以阐明它们在菌核子实体萌发中的功能.

  • 图 1  核盘菌假定几丁质酶家族蛋白功能域分析

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    图 2  核盘菌假定几丁质酶家族系统发育关系

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    图 3  核盘菌菌核子实体萌发阶段各几丁质酶基因的表达

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    表 1  RT-PCR所用引物

    基因编号 引物序列(5′→3′)
    SS1G_11212 ACCGTATCCCTCAACCCTAATG
    ATTGATCGCATCGAGAAATCC
    SS1G_00677 TTTGATACCACAGCCGTCCC
    CGAACTAAGCCAGCCCTCTAC
    SS1G_03420 CACTGTCGCTCTTCGTCTGA
    GGTATTCGGGTCTCGTGCT
    SS1G_05897 ATGCAAATGCCCGTTGATG
    CCGACTTTCCGAAATGGTCT
    SS1G_08020 CGCTCATCAAGCAAACCTATC
    AGAAGCCCATGTTCCCTGTC
    SS1G_08695 CATCATTCCCATCGCTTTCTT
    CGGCAGTAGTGGCTTCATCAG
    SS1G_11304 GGTGGCTGGACCTATTCATCT
    CCGTGCTTCATCGGTGTTT
    SS1G_11700 CTTGAAGGCTATTCGCTCTGC
    GGTGTTATCCCAGGACCCAGA
    SS1G_00773 ACGCTGATTTGATGAGATTGC
    TTTCCTCCAAGTTTCTTCCCT
    SS1G_05454 AAATGACGATGGGTTTGGGT
    TCAGCGTGTCGCATGTATGA
    SS1G_12510 GCAGCAAACACTGGTGGACA
    CTTGGAAGGGAGAAATGAGCC
    SS1G_13155 GCTGAGGGAGTTTCTGTTTCG
    TAGATTGTCTCGGTGGTTACGG
    Beta-tubulin GTGAGGCTGAGGGCTGTGA
    CCTTTGGCGATGGGACG
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    表 2  核盘菌假定几丁质酶家族蛋白性质分析

    基因编号 编码蛋白 相对分子质量 PI 信号肽 信号肽长度 蛋白定位 结构域
    SS1G_11212 ChitinaseⅡ 6.9×104 4.97 无 - 胞外 Glyco_18，CBM
    SS1G_00677 ChitinaseⅡ 5.2×104 4.90 有 19 分泌到胞外 Glyco_18，ChtBD
    SS1G_03420 ChitinaseⅡ 3.5×104 4.80 有 15 分泌到胞外 Glyco_18
    SS1G_05897 ChitinaseⅡ 3.4×104 6.09 无 - 胞外 Glyco_18
    SS1G_08020 ChitinaseⅡ 7.5×104 8.29 无 - 胞外 Glyco_18
    SS1G_08695 Chitinase Ⅲ 4.4×104 5.70 有 22 分泌到胞外 Glyco_18，CBM
    SS1G_11304 ChitinaseⅡ 4.4×104 4.94 无 - 胞外 Glyco_18
    SS1G_11700 ChitinaseⅡ 4.8×104 6.49 有 23 分泌到胞外 Glyco_18
    SS1G_00773 ChitinaseⅡ 1.9×105 4.79 有 18 分泌到胞外 Glyco_18，ChtBD
    SS1G_05454 ChitinaseⅡ 1.9×105 4.95 有 19 分泌到胞外 Glyco_18，ChtBD
    SS1G_12510 ChitinaseⅡ 1.2×105 5.95 无 - 胞质 Glyco_18，ChtBD
    SS1G_13155 ChitinaseⅡ 1.2×105 4.49 无 - 胞核 Glyco_18
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出版历程
  • 收稿日期:  2017-10-30
  • 刊出日期:  2019-01-20

核盘菌几丁质酶基因家族分析与表达特性研究

    通讯作者: 余洋, 副教授
    作者简介: 杜娇(1992-), 女, 硕士研究生, 主要从事分子植物病理学研究
  • 1. 西南大学 植物保护学院, 重庆 400715
  • 2. 凉山民族师范学校, 四川 西昌 615000
  • 收稿日期:  2017-10-30
基金项目:  重庆市基础与前沿研究一般项目（cstc2017jcyjAX0096）；中央高校基本科研业务费“创新团队”专项（XDJK2017A006）

摘要: 核盘菌菌核以子实体形式萌发是作物菌核病病害循环中关键性的一环，研究菌核子实体萌发分子机理将为菌核病的安全控制提供线索.该研究通过生物信息学方法对核盘菌几丁质酶基因家族进行分析，并利用实时荧光RT-PCR对其在菌核子实体萌发阶段的表达进行探讨.生物信息学分析表明核盘菌中共有12个基因编码假定的几丁质酶，它们均具有GH18结构域，部分蛋白还具有几丁质结合结构域和纤维素结构域；除SS1G_11212外其余蛋白均为亲水性蛋白；亚细胞定位预测表明其中10个假定几丁质酶位于胞外，其余2个分别位于细胞核和细胞质中.通过构建系统发育树分析发现假定几丁质酶可以分为2大类，其中3个与酵母几丁质酶CTS1归为一类，其余9个与CTS2归为另一类.除SS1G_00773外，其余11个几丁质酶基因在核盘菌菌核子实体萌发过程中表达量均有变化，推测几丁质酶家族蛋白可能参与核盘菌菌核子实体萌发过程.

English Abstract

    全文HTML

  • 核盘菌[Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary]是一种世界性分布的重要植物病原真菌，寄主范围十分广泛，能侵染75科278属450多种植物[1]，由它引起的作物菌核病每年都造成巨大的经济损失[2-3].由于缺乏高抗的种植品种，到目前为止对菌核病的防治仍以化学防治为主[4-7].长期使用化学农药已导致田间核盘菌菌株出现严重的抗药性，开发新的防治方法迫在眉睫.

    核盘菌能在寄主上产生坚硬、黑色的菌核，菌核以子实体形式萌发并释放的子囊孢子是作物菌核病的重要初侵染来源[2].为有效抵抗外界不良环境，菌核中的细胞壁外围绕着较厚的碳水化合物层.菌核萌发过程中需要分泌多种多糖水解酶来降解细胞壁，使得子囊柄原基穿透菌核，但到目前为止在其中起关键性作用的水解酶及其功能仍不清楚.研究表明菌核加厚的细胞壁主要由β-葡聚糖、几丁质以及其他多种未知多糖共同组成[8-9].几丁质是由N-乙酰-D-氨基葡萄糖以β-1，4糖苷键连接而成的长链多聚物[10].几丁质酶可将几丁质水解为几丁寡糖和N-乙酰-D-氨基葡萄糖单体[11]，在动物、植物、微生物中均有分布[12-19].研究核盘菌几丁质酶的功能将为揭示核盘菌菌核的子实体萌发机制提供线索，也为开发新的安全的菌核病防治措施奠定基础.

    自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的几丁质酶基因CTS1和CTS2被克隆之后[20-21]，随着越来越多的丝状真菌基因组测序完成，许多真菌几丁质酶基因家族已被鉴定并进行了分析[22-23].丝状真菌基因组中一般含有10~25个几丁质酶，且都属于糖基水解酶18家族[24].韩艺娟等[25]对稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)假定几丁质酶家族基因表达进行分析，指出几丁质酶家族蛋白可能参与稻瘟病菌的生长发育、形态建成和致病过程.部分几丁质酶基因功能已经通过基因敲除等方法进行了深入研究[26]. Takaya等[27]破坏构巢曲霉(Aspergillus nidulans)中几丁质酶基因chiA，发现菌丝生长和分生孢子形态没有发生变化，但是分生孢子的萌发率和菌丝的生长速率明显降低. Yamazaki等[28]敲除构巢曲霉几丁质酶基因chiB，发现该基因缺失对菌丝的生长速率没有影响，却降低了细胞内外几丁质酶活性影响了菌丝的自溶.李培[29]通过RNAi稻瘟病菌几丁质酶基因的表达，发现菌丝生长和孢子分化出现异常. Dünkler等[30]敲除棉病囊霉(Ashbya gossypii)中几丁质酶基因AgCts2后，发现该基因缺失不会影响菌丝的生长及形态建成，但会形成异常的子囊孢子.这些研究表明几丁质酶在丝状真菌的生长发育过程中起着重要作用.

    迄今为止，对于核盘菌菌核子实体萌发过程中起关键性作用的几丁质酶及其功能仍不清楚.本研究拟通过生物信息学方法深入分析核盘菌几丁质酶基因家族的特性，并利用实时荧光RT-PCR方法对其在菌核子实体萌发过程中的表达模式进行探讨，研究结果将为深入揭示几丁质酶基因在核盘菌生长发育中的作用奠定基础，也为菌核病的安全防治机制提供线索.

1.   材料与方法

    1.1.   材料

    1.1.1.   菌株

  • 核盘菌野生型菌株1980于4 ℃条件下保存. PDA培养基用于培养核盘菌菌株；胡萝卜培养基用于培养核盘菌菌核.

    • 1.1.1.   主要试剂

  • TRIzol试剂购于上海华舜生物工程有限公司；DNase购于大连宝生物工程有限公司；ReventAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒购于MBI Fermentas公司；2×SYBR Green Realtime PCR Master Mix购于东洋纺生物科技有限公司；其他试剂为国产分析纯.

    • 1.2.   方法

    1.2.1.   核盘菌假定几丁质酶氨基酸序列的获取及其生物信息学分析

  • 在核盘菌基因组数据库(http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/Scleraotinia_sclerotiorum/GenomesIndex.html)中直接检索获得糖苷水解酶18家族12个成员的氨基酸序列，并用于后续相关生物信息学分析.在线软件SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-2.0/)进行信号肽预测，ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/)预测蛋白相对分子质量、等电点(PI)及疏水性(GRAVY)，ProtComp 9.0进行蛋白定位，Motif Scan(http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan)与Prosite(http://prosite.expasy.org/prosite.html)预测蛋白结构域，MEGA(Molecular Evolutionary Genetics Analysis)4.0构建蛋白的系统发育树.

    • 1.2.2.   核盘菌菌核子实体萌发的诱导

  • 将核盘菌1980菌株于胡萝卜培养基中20 ℃下培养1个月后收集菌核.菌核于5%次氯酸钠溶液中消毒后用无菌水漂洗3次洗净.将菌核半埋于灭菌的湿润河沙中，16 ℃条件下直到其萌发形成初始子囊柄.

    • 1.2.3.   核盘菌假定几丁质酶基因表达分析

  • 用TRIzol试剂按说明书分别提取和萌发形成子囊柄的菌核总RNA，并用DNAse处理总RNA.用ReventAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒合成cDNA第一链.以合成的cDNA为模板，进行RT-PCR扩增，使用仪器为CFX96TM Realtime System (Bio-Rad，Hercules，CA，USA).反应体系为2×SYBR Green Real time PCR Master Mix：10 μL，正/反向引物各0.2 μmol/L，cDNA模板：40 ng，总体积：20 μL.反应程序为95 ℃，2 min (1 cycle)；95 ℃ 20 sec，56 ℃ 15 sec，72 ℃ 20 sec (40 cycles).荧光读数设在56 ℃.以核盘菌Beta-tubulin基因(tub1，SS1G_04652)为内参进行基因表达分析，实验重复3次，利用Excel软件进行数据统计分析. RT-PCR引物(表 1)由生工生物工程股份有限公司合成.

2.   结果与分析

    2.1.   核盘菌几丁质酶家族分析

  • 核盘菌中共12个假定的几丁质酶蛋白，分别为SS1G_11212，SS1G_00677，SS1G_03420，SS1G_05897，SS1G_11304，SS1G_11700，SS1G_00773，SS1G_05454，SS1G_08020，SS1G_12510，SS1G_13155和SS1G_08695.几丁质酶蛋白相对分子质量在3.4×104~1.9×105之间.等电点(PI)值位于4.49~8.29之间.除SS1G_11212为疏水性蛋白外(GRAVY值为0.117)，其余蛋白均为亲水性蛋白(GRAVY值为负数).利用SignalP 4.1进行信号肽预测分析发现，其中6个假定的几丁质酶(SS1G_00773，SS1G_00677，SS1G_03420，SS1G_05454，SS1G_11700，SS1G_08695)在N端具有典型的信号肽结构，信号肽的平均长度为19.3.利用ProtComp 9.0对假定的几丁质酶进行蛋白定位预测，结果表明具有信号肽的假定几丁质酶均位于胞外.在另外6个假定的几丁质酶中，SS1G_05897，SS1G_08020，SS1G_11304和SS1G_11212位于胞外，SS1G_13155定位于细胞核，SS1G_12510位于细胞质中(表 2).对假定的几丁质酶进行蛋白结构分析，结果表明12个蛋白均含有糖苷水解酶18(Glyco_18)催化结构域.此外，SS1G_00677，SS1G_00773，SS1G_05454和SS1G_12510蛋白还具有几丁质结合结构域(Chitin-binding domain，ChtBD). SS1G_11212和SS1G_08695蛋白中具有纤维素结合结构域(Cellulose-binding domain，CBM)(图 1).

    • 2.2.   核盘菌几丁质酶家族系统发育关系分析

  • 图 2中12个假定几丁质酶蛋白可以分为2大类，SS1G_13155，SS1G_08695和SS1G_11212聚为一类，与CTS1同源性较高. SS1G_00677等9个假定几丁质酶聚为一类，与CTS2同源性较高.这9个假定几丁质酶可以分为3个亚类：第1亚类包含SS1G_08020，SS1G_11304，SS1G_11700和SS1G_05897，该亚类中的蛋白与CTS2同源性最高；第2亚类包含SS1G_00677，SS1G_05454，SS1G_00773和SS1G_12510；第3亚类仅有SS1G_03420蛋白.

    • 2.3.   核盘菌假定几丁质酶基因的表达

  • 为研究几丁质酶家族基因在核盘菌中的作用，通过实时荧光RT-PCR方法检测了它们在核盘菌菌丝生长及菌核发育各阶段的表达量(图 3). SS1G_00677，SS1G_03420，SS1G_05897，SS1G_08020，SS1G_05454和SS1G_12510基因在菌核子实体萌发阶段表达量升高，而SS1G_11212，SS1G_08695，SS1G_11304，SS1G_11700和SS1G_13155基因在菌核子实体萌发阶段表达量下降.此外，SS1G_00773基因在核盘菌菌核子实体萌发阶段表达量几乎无变化.

3.   结论

  • 本研究发现核盘菌几丁质酶家族共有12个成员，有6个假定几丁质酶(SS1G_03420，SS1G_05897，SS1G_08020，SS1G_11700，SS1G_00773和SS1G_13155)属于A亚组，它们仅含有一个催化区，没有几丁质或纤维素结合域.这6个假定几丁质酶除SS1G_13155外，均定位于胞外，推测这些蛋白的主要作用区在细胞外. B亚组除含有催化区外，还含有一个纤维素结合域，在核盘菌中共有2个假定几丁质酶归属于B亚组，包括SS1G_11212和SS1G_08695，它们具有富含丝氨酸/苏氨酸结构域(Serine/threonine rich domains)，推测这2个蛋白成熟后可能结合细胞膜发挥作用.剩余的4个假定几丁质酶属于C亚组，它们蛋白相对分子质量较大，除含有一个催化区外，在靠近N端还含有1~2个几丁质结合域，该结合域能够有效地增强几丁质酶对几丁质底物的亲和性，提高酶的活性[31].

    系统发育树分析表明核盘菌12个假定几丁质酶中有3个与酵母几丁质酶CTS1聚为一类，主要包括B亚组的2个蛋白和A亚组的SS1G_13155，其中CTS1与B亚组蛋白同源性最高.研究表明CTS1与酵母细胞相互分离相关，CTS1基因缺失突变体细胞分离不完全，形成大量假菌丝[32-33].构巢曲霉B亚组几丁质酶CHIA与细胞壁重塑密切相关[27]. SS1G_11212和SS1G_08695在核盘菌中的功能还不清楚，推测有可能在菌核子实体萌发细胞壁重塑中起着重要作用.另外9个假定几丁质酶与CTS2聚为一类，主要包括A亚组和C亚组蛋白，其中A亚组与CTS2同源性最高.酵母CTS2基因敲除突变体与野生型菌株没有差别，但棉病囊霉CTS2蛋白编码基因AgCts2被破坏后突变体形成异常的子囊孢子[30].与棉病囊霉相比，核盘菌通过菌核子实体萌发形成子囊孢子的过程更加复杂，A亚组几丁质酶在该过程中的作用有待于进一步研究.

    本研究对几丁质酶基因在菌核子实体萌发阶段的表达进行了分析，结果显示11个基因在菌核子实体萌发前后表达量都出现了变化，推测几丁质酶参与了核盘菌的菌核子实体萌发过程.其中6个基因在菌核子实体萌发阶段上调表达，它们分布于A亚组和C亚组，预示这2个亚组在菌核子实体萌发中所起的作用.下一步需要通过对单个基因分别进行敲除或者沉默，以阐明它们在菌核子实体萌发中的功能.

参考文献 (33)

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