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水稻(Oryza sativa L.)属于禾本科草本植物，迄今为止在中国的栽培历史已有数千年，是中国重要的粮食作物[1].有研究显示，全世界大约有60%以上的人口以稻米为主食[2].在我国，由于庞大的种植面积和高产的稻米产量让水稻在我国拥有较高的地位[3].水稻产量出现过两次大的飞跃，分别是矮化育种和杂种优势利用.我国开始进行杂交水稻的研究是在20世纪60年代；在20世纪70年代前期完成籼型和粳型水稻的“三系”配套，在中期开始进行杂交水稻推广，这些措施使得水稻增产了20%左右[4].在此之后，育种家们虽然选育了许多品种，但与早期品种汕优63相比，水稻产量和品质等方面并没有得到显著性的提高，杂交水稻育种到了一个瓶颈期，杂交稻存在品种同质化严重、差异性小等现象.因此，要想提高杂交稻品种的产量和质量，就有赖于突破性骨干恢复系亲本的选育和应用.
恢复系是杂交水稻进行三系配套的关键亲本，在保证恢复系具有较强恢复能力的同时，还要求恢复系具备其他优良性状，这样在进行配套时才能拥有较强的杂种优势.在恢复系育成的30多年中，我国水稻育种家先后已育成了很多恢复系，第一批恢复系是以常规品种进行筛选的，主要筛选到的品种有IR24、IR26、IR661、泰引1号、密阳46、IR9761-19-1等[5].在对现已育成的恢复系进行遗传分析时发现，这些恢复系大多都是由一些骨干亲本，如明恢63、蜀527、成恢727、辐恢838、华占等品种育成的，其遗传背景基本相似且遗传基础较为狭窄，杂种优势变弱.据统计，利用恢复系华占配组出了111多个杂交稻品种，其中以华占为父本，选育出了15个优秀衍生恢复系材料，配组出了60个左右的衍生杂交稻组合.王颖姮等[6]选用120对SSR标记，对19份在生产上大面积推广的骨干恢复系材料进行遗传多样性研究分析，结果将19份恢复系聚成两大类群，其中第Ⅱ类群中的恢复系大多都是明恢63的衍生系.三系杂交水稻产量受到制约，没有得到进一步提高的原因可能是由于两大杂种优势群体内水稻品种资源遗传多样性相对贫乏[7].因此，加快新恢复系选育，对于丰富我国育种遗传资源，拓宽遗传基础具有重要作用，同时也能为杂交稻的选育提供优良的基因资源.
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选用野败型不育系广8A与强恢复系云恢1973构建群体进行分子标记筛选；课题组前期用云恢1973为供体材料，与籼型优质软米云恢290杂交得到云恢1973的F8代共300株重组自交系材料进行新恢复系筛选.
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采用广8A为母本、云恢1973为父本构建F2代群体，将群体种植于云南富民，调查花粉育性和小穗育性获得表型数据，结合SSR(Simple Sequence Repeats)分子标记筛选到与云恢1973恢复基因紧密连锁的标记；将课题组在前期用云恢1973为父本与云恢290构建的重组自交系共300株材料种植在海南三亚试验田里，用以上研究得到的与恢复基因紧密连锁的SSR引物去检测这300株的基因型；筛选出含有云恢1973恢复基因的单株，将筛选出来的单株下一季种植于云南水富和云南峨山进行对比鉴定，并筛选出含有云恢1973恢复基因、综合农艺性状优良的新恢复系材料.
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水稻花粉镜检参照姚克敏等[8]的研究方法；小穗结实率调查方法参照《水稻新品种测试原理与方法》[9]，计算公式为：
式中：SSR代表小穗结实率、GPP代表每穗实粒数、GNPP代表每穗粒数.
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在田间选取亲本和F2代单株，并标注好株系号，取其幼嫩叶片放置于保鲜袋中立刻带回实验室，采用CTAB法[10]进行DNA提取，选取700对均匀分布于水稻12条染色体上的SSR分子标记作为初步筛选的引物，PCR反应采用10 μL的反应体系，其中包括Primer(10 ng/μL)1.0 μL，模板DNA(约10 ng/μL)1.0 μL，Taq酶(10 U/μL)5.0 μL，灭菌双蒸水3.0 μL.在Biometra PCR仪上进行扩增，一般反应条件为：95 ℃预变性5 min；94 ℃，30 s，50~60 ℃，30 s，72 ℃，40 s，共35个循环；72 ℃再延伸10 min.反应产物在8%垂直平板聚丙烯酰胺凝胶上电泳，最后经0.1%硝酸银染色后在凝胶成像仪上拍照观察.
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新恢复系测定株高、穗长、单株有效穗、千粒质量、穗粒数、结实率、单株产量、粒长、粒宽、直链淀粉含量等10个性状，其中农艺性状指标测定方法参考《水稻新品种测试原理与方法》[9]，采用SC-E米质扫描仪(杭州万深)进行粒型测定，按《稻米直链淀粉的测定分光光度法》(NY/T2639-2014)进行直链淀粉含量测定.综合以上10个性状测定结果进行评价.
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用Map Manager QTXb 19软件中的复合区间作图，获得与恢复基因连锁的SSR分子标记.其余分析用Excel 2015、SPSS 23.0统计软件进行数据分析.
1.1. 试验材料
1.2. 试验设计
1.3. 测定内容及方法
1.3.1. 水稻育性测定
1.3.2. 分子标记筛选
1.3.3. 农艺性状及品质指标测定
1.3.4. 数据分析
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2021年4月将构建好的广8A/云恢1973的F1、F2代群体种植于云南富民的试验田里，F1代种植了90株，F2代种植了118株，待水稻盛花期时F1代随机取10株第二天即将要开放的花粉进行镜检，F2代118个单株全部取样进行花粉镜检；待水稻成熟期，将F1代取花粉的10株进行小穗结实率调查，F2代118个单株全部取样进行小穗结实率调查.F1、F2代花粉育性和小穗育性数据分析结果如表 1所示.
由表 1可知，F1代花粉育性全部表现为正常，F2代有不育花粉出现.花粉育性和小穗育性试验结果完全符合孢子体不育的遗传特点，可以用于后续分子标记筛选试验.
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选用的700对SSR引物在双亲间具有多态性的有136对，通过在双亲间具有多态性的这136对标记，再对F2代群体的118个单株进行检测，获得基因型数据，并结合花粉育性(PF)和小穗育性(SF)的表型数据，利用Map Manager QTXb 19软件进行分析，获得与恢复基因连锁的SSR分子标记，结果见表 2.其中，筛选到与花粉育性相关的标记有10个，分别位于10，11号染色体上；与小穗育性相关的标记有11个，分别位于2，10号染色体上；两个性状一共筛选到12个标记，其中位于10号染色体上的9个标记是两个性状共有的.
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2021年10月将课题组前期用云恢1973与云恢290创制的300株F8代衍生系种植在海南三亚试验田，并用上述研究筛选到的与恢复基因紧密连锁的12个分子标记对这300份材料进行恢复基因位点的快速扫描，最后综合12个分子标记筛选的结果，共计筛选到云恢290/云恢1973的后代材料中含恢复基因的株系有72份.
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将筛选得到的含恢复基因的72份株系于2022年3月在云南水富和云南峨山种植，在水稻盛花期分别取两个试验点的花粉进行镜检，镜检分析结果表明(表 3、图 1)：两个试验点花粉育性差距较小.从恢复系来看，峨山试验点花粉育性平均值为94.89%，水富试验点平均值为92.44%；对照云恢1973平均值为91.60%，87.59%；结果表明新筛选到的恢复系正常可育.
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由于出苗、虫害、病害、鼠害等原因，到成熟期有19份恢复系没有收获到种子，在两个试验点收获到种子的恢复系材料有53份(表 4)，可见参试的53份恢复系材料各个性状都存在极显著差异.在峨山试验点，株高、穗长、单株有效穗、结实率、单株产量的平均值高于对照云恢1973，而千粒质量、每穗粒数的平均值低于对照；在水富试验点，株高、穗长平均值高于对照，单株有效穗、千粒质量、每穗粒数、结实率、单株产量5个性状的平均值低于对照.
在峨山试验点与产量相关性状表现较好的材料如表 5所示，其中材料872单株有效穗达到18穗，分蘖能力较强；材料697每穗粒数最多，超过了310粒，属于超多粒型育种材料；材料786、789籽粒较大，千粒质量超过34 g；有15份材料拥有较高结实率，结实率达到80%以上；以云恢1973为对照，有35份材料单株产量较高，均超过33.23 g.
在水富试验点与产量相关性状表现较好的材料如表 5所示，其中材料699-1分蘖能力最强，有14穗；材料679、829-1的每穗粒数超过300粒；材料789千粒质量达到33.83 g，属于大粒材料；材料701-1的结实率达到87.30%；单株产量超过对照云恢1973产量的材料有25份.
综合两个试验点数据，单株有效穗在10穗以上的材料有703、706-1、742等11份，其中836分蘖能力最强，在峨山试验点有15穗，在水富试验点有13穗；每穗粒数在250粒以上的材料有697、698、699-2等8份材料；千粒质量在30.53 g以上的材料有8份，即699-2、742、743、786、789、858、858-1、859，这8份材料籽粒较大，其中材料789在两个试验点千粒质量都是所有恢复系中最大的，在峨山试验点达到了35.47 g，在水富试验点达到了33.83 g.结实率在80%以上的材料有681、699-2、701、701-1、703、734、739等8份材料；共有19份材料的单株产量在两个试验点都高于对照云恢1973，这19份恢复系材料都是今后提高水稻产量的重要育种资源.
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53份恢复系材料外观品质及直链淀粉含量数据分析，以直链淀粉含量为评判指标，筛选食味品质和加工性能较好的恢复系，结果如表 6所示.在峨山试验点，直链淀粉含量低的材料有6份，在水富试验点，直链淀粉含量的材料有14份，其中697、699-1、699-2、706、713、836这6份材料在两个试验点都拥有较低直链淀粉含量，属于籼型软米，食味品质较高.在峨山试验点，直链淀粉含量高的材料有32份，在水富试验点，直链淀粉含量高的材料有33份，其中恢复系661、672、679等29份材料在两个试验点直链淀粉含量都较高，属于加工性能较好，但食味品质较差的材料(表 7).
2.1. 广8A/云恢1973 F1、F2代群体的水稻育性分析及分子标记筛选
2.1.1. 育性分析
2.1.2. 分子标记筛选
2.2. 分子标记辅助选择含恢复基因单株及新恢复系评价
2.2.1. 新恢复系花粉育性分析
2.2.2. 农艺性状评价
2.2.3. 新恢复系外观米质及直链淀粉含量评价
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水稻雄性不育恢复性的遗传机制一直是人们研究的热点，前人在对水稻WA型细胞质雄性不育系的研究中，发现在1号染色体上存在能让育性恢复的Rf3基因[11]及10号染色体上的Rf4基因[12-13].试验结果是RM6100-RM6745的似然值最大，表明在这个区段存在育性恢复基因的可能性最大，这个研究结果与亓芳丽[14]的研究结果相同，证明了本试验结果的可靠性.但在RM6100-RM6745区段存在的能使育性恢复的基因是Rf4或是其他基因，还需进一步加密标记和扩大群体进行验证.本研究在2，11号染色体上发现的两个标记，未见前人报道，试验初步推测这两个标记是控制育性的微效基因，具体效应有待下一步探究.
传统育种主要是以田间水稻植株的表现型作为主要选择指标，选择结果容易受到天气、土壤等外界环境影响，而一些表型复杂的性状可能会受到主效基因和微效基因的双重影响，因此通过单一的表型指标进行选择可能导致试验结果不准确.目前，以PCR为基础的SSR分子标记技术正广泛地应用于植物遗传育种研究中，因其具备许多传统育种没有的优越性而成为现代分子育种的一个重要手段[15].通过分子标记辅助选择筛选到的72份恢复系花粉育性大多都表现为正常可育，花粉育性都在90%以上，且配制的组合花粉育性大部分也表现为正常可育，花粉育性在80%以上，表明筛选的新恢复系具有育性恢复能力，同时也证明了分子标记辅助选择结果的可靠性.通过对恢复系农艺性状的分析发现，株高在两个试验点差距较大，平均株高相差16.1 cm，其主要原因是峨山试验点与水富试验点光照强度以及日照时间相差较大，而光照是作物进行光合作用的主要能量来源[16-17]，水稻生长及产量容易受到自然环境因子温度、降雨量、光照等因素的影响[18].在水富试验点单株有效穗、千粒质量、每穗粒数、结实率、单株产量的平均值都低于对照云恢1973，分析原因可能是因为2022年水富出现极端天气，最高温度达到了42 ℃左右，而一部分恢复系材料不适应这样的极端温度，造成生长发育异常所致.
随着经济快速发展，人民生活水平得到显著提高，在吃饱的同时人们开始注重怎样吃好.稻米品质通常受直链淀粉含量的影响，曾亚文等[19]以籼稻为试验材料，得出当直链淀粉含量为9%~15%时属于籼型软米.本研究筛选到的697、699-1、699-2、706、713、836这6份恢复系在两个试验点直链淀粉含量都较低，是食味品质较好的材料.恢复系697-1、698、699、730、734、836-1、872这7个材料直链淀粉含量在两个试验点间存在较大差异.前人研究发现，稻米直链淀粉含量受灌浆期温度、光照强度、海拔、收获时期、储藏条件等因素的影响[20-23].当水稻直链淀粉含量高时，稻米的持水力较低、吸水性较差、糊化温度较高、所含热量较低.通常直链淀粉含量高的水稻可以作为米粉加工的主要原材料，或用于其他的工业用途[24]. 在峨山试验点，直链淀粉含量高的材料有32份，在水富试验点，直链淀粉含量高的材料有33份，其中有661、672、679等29份恢复系在两个试验点直链淀粉含量都较高，属于高直链淀粉材料，可作为米粉加工的原材料.
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由SSR分析有12个标记与云恢1973恢复基因紧密连锁，利用分子标记辅助选择云恢290/云恢1973创制的F8代共300份重组自交系材料，筛选到72份含恢复基因的新恢复系，鉴定结果表明新恢复系花粉育性正常，单株有效穗在10穗以上的材料有11份，每穗粒数在250粒以上的材料有8份，千粒质量在30.53 g以上的材料有8份，结实率在80%以上的材料有8份，单株产量高于对照的材料有19份，直链淀粉含量低的材料有6份、直链淀粉含量高的材料有29份.