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番茄(Solanum lycopersicum)是茄科茄属一年生草本植物，在日常生活和饮食中扮演着极为重要的角色。番茄具有美容护肤、促进消化、预防疾病和增强免疫力等功效[1]。近年来，由于番茄生产复种指数高、施肥量大、封闭性强、温度高等，土壤中病原菌的数量不断增加，根腐病发生频繁，严重影响了番茄的产量和品质。番茄根腐病病原菌在土壤中存活时间长，主要危害植株茎基部和根部，导致根部腐烂，吸收水分和养分的功能减弱，严重时植株枯死[2]，因此，科学的预防和治理番茄根腐病尤为重要。
根腐病的防治主要采取农业防治和化学防治，农业防治操作繁琐、周期较长且见效较慢；化学防治3R(抗性Resistance、再增猖獗Resurgence、残留Residue)问题突出。生物防治是一种环保、健康且经济的防治方法，番茄根腐病的生物防治目前已取得较大进展。研究表明，防治番茄根腐病的生防微生物主要有芽孢杆菌属(Bacillus spp.)、假单胞菌属(Pseudomonas spp.)、链霉菌属(Streptomyces spp.)、非致病性镰刀菌属(Fusarium spp.)和木霉属(Trichoderma spp.)[3-6]。链霉菌以能够产生丰富的次生代谢物而闻名，天蓝色链霉菌的基因组序列中包含了20多个次级代谢产物的生物合成基因簇[7]。2016年Goudjal等[8]分离出3株链霉菌，能对引起番茄根腐病的尖孢镰刀菌的菌丝生长表现出强烈的拮抗性，显著降低了根腐病的发生率。链霉菌能产生大量的抗生素，基本不产内毒素，致病性小，可进行高密度的培养，工业规模发酵技术基础良好，这些优点使链霉菌在根腐病的防治中有着广泛的应用前景。基于此，本研究从陕西省咸阳市番茄根腐病发病严重的田块中分离并鉴定病原菌，并以其为靶标菌，通过平板对峙法筛选出对番茄根腐病病原菌抑菌效果优良的生防链霉菌，开展温室盆栽试验，旨在为挖掘并研发出对番茄根腐病具有高效防治作用的微生物菌剂奠定基础。
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供试菌株：番茄根腐病株采集自陕西省咸阳市根腐病发病严重的田块；12株生防菌由西北农林科技大学植物保护学院蔬菜病害及生物防治实验室分离保存。
番茄种子(白果强风)，新乡市金旺杰种业有限公司；甲霜恶霉灵水剂，山东利邦农化有限公司。
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病原菌的分离：取患病番茄植株根部，采用组织分离法得到纯培养物。根据柯赫氏法则[9]进行验证：将分离得到的纯培养物采用浸根法回接到番茄植株上，以无菌水处理为对照，观察番茄的生长状况。
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病原菌的形态观察：将分离的病原菌接种于PDA培养基上，观察病原菌在培养基上的形态、颜色等特征，在光学显微镜下观察其孢子及产孢结构，记录孢子形态、颜色、大小等。
病原菌分子生物学鉴定：利用真菌试剂盒提取病原菌DNA，参照王彤彤等[10]的方法。对提取到的DNA利用ITS序列通用引物(ITS1：5′-TCCGTAGGTAACCTGCGG-3′；ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)进行PCR扩增。对扩增后的产物进行电泳检测，以确保目的条带清晰准确；送至擎科生物科技有限公司完成DNA测序，测序结果在NCBI(
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ )中进行BLAST同源比对，下载相似性高的菌株，并利用MEGA 11软件通过NeighBour-Joining(NJ)法完成系统发育树的构建，重复1 000次。 -
以分离到的番茄根腐病病原菌为靶标病原菌，以实验室保存的菌株为拮抗菌，采用平板对峙法筛选出对番茄根腐病病原菌抑菌效果良好的生防菌。用打孔器将病原菌打成直径为6 mm的菌饼，菌丝面朝下接种于PDA培养基平板的中央，在两侧相等的距离接种生防菌，以未接种生防菌的另外两侧作为对照，在28 ℃下培养7 d后，测量对照组菌落和处理组菌落的半径，并计算抑菌率[11-12]，每个处理重复3次。
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培养特征观察：将生防菌SC-6分别划线接种于ISP1-ISP7、高氏一号、PDA等培养基上，28 ℃恒温培养7 d，观察并记录生防菌株在9种培养基中菌丝是否生长良好、气生菌丝颜色、基内菌丝颜色及可溶性色素的颜色。
生理生化指标测定：生理生化特性试验参考《链霉菌鉴定手册》[13]进行。耐盐性试验和生长温度等生态条件试验参考陈婧[14]的方法。
形态特征观察：将生防菌SC-6在高氏一号琼脂培养基上培养7 d后，置于扫描电子显微镜(SEM)下观察并拍照。
分子生物学鉴定：操作同1.2.2，使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取生防菌株DNA，对提取到的DNA采用细菌通用引物进行16S rDNA的PCR扩增，扩增所用引物及退火温度参照陈婧[14]的数据。
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生防菌SC-6发酵液的获取：将培养好的生防菌SC-6接种于高氏一号液体培养基中，28 ℃ 160 r/min，摇培7 d，得到发酵液原液。
将番茄种子消毒后播种于无菌基质中，等番茄苗长出3~5片真叶挑取长势均匀的幼苗进行接菌移栽。采用灌根的方式接种生防菌，设置灌生防菌发酵液10倍液、100倍液、1 000倍液3个处理，设置灌空白培养基处理为对照，每株番茄苗灌30 mL，20 d后测量番茄植株的株高、根长、地上鲜质量和干质量、地下鲜质量和干质量等生理指标[15]，3次重复。
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病原菌孢子液的获取：将培养好的番茄根腐病病原菌接种至PDA培养基中，28 ℃、160 r/min摇培7 d，用双层无菌纱布过滤后用无菌水配制成浓度为1×107 CFU/mL的病菌孢子悬浮液。
番茄播种和移栽方法同1.2.5，移栽前将番茄幼苗的根部浸泡在病原菌的孢子液中2 h进行接菌，然后将带菌幼苗移栽进小花盆(长5 cm，宽5 cm，高7 cm)里，每盆1株，将花盆浇透水。24 h后用供试生防菌的发酵液进行灌根处理，每株30 mL，用接种等体积的高氏一号培养液作为空白对照，按照产品说明书使用甲霜恶霉灵作为化学药剂对照，20 d后观察番茄的发病情况，计算防效。每处理15株，重复3次。番茄根腐病分级标准[16]为：0级：无病；1级：茎上出现些微水渍状的病斑；2级：茎上病斑扩展，但不超过株高1/4，不萎蔫；3级：病部超过整株1/4，向下延伸至根部不超过株高3/4，茎基部轻微萎蔫；4级：病部超过整株或蔓延至全株，包括根和叶柄，茎基部严重缢缩，叶片枯萎，已死亡。病情指数(D)和相对防效(E)计算公式为：
式中：S为各级病株数；L为相应级别；T为调查总株数；M为最大级别。
式中：DCK为对照病情指数；Dh为处理病情指数。
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利用Excel 2010进行数据整理，防治效果、抑菌率等数据采用SPSS 26.0统计软件，应用Duncan氏新复极差法进行差异显著性分析，采用Adobe Photoshop 2018软件绘图。
1.1. 材料
1.2. 方法
1.2.1. 病原菌的分离
1.2.2. 病原菌的鉴定
1.2.3. 生防链霉菌的筛选
1.2.4. 生防链霉菌的种类鉴定
1.2.5. SC-6发酵液对番茄幼苗生物量的影响
1.2.6. SC-6发酵液对番茄根腐病的防治效果
1.3. 数据分析
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从患病番茄根部分离出1株病原菌，将其回接到番茄根部，7 d后发现对照组长势明显好于处理组(图 1)。从表现出典型病症的植株中重新分离出病原菌，获得生长性状与原始分离到的病原菌一致的培养物，证明原培养物是番茄根腐病的病原菌。
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结果表明：病原菌在PDA培养基上生长迅速，7 d可长满全皿，菌落呈白色绒毛状，气生菌丝较为发达，生长后期产生黄褐色色素(图 2a、2b)。光学显微镜下观察产孢情况，发现在PDA培养基上产孢较丰富，分生孢子梗多分枝(图 2c)。大型分生孢子呈月牙形，孢子较弯曲，有3~6隔，约20~40 μm(图 2d)；小型分生孢子呈卵圆形，有或无隔，约10~25 μm(图 2e)。
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将测序结果在NCBI上比对，显示ITS基因序列与木贼镰孢菌(F. equiseti)有较高的相似度。基于ITS基因序列用NJ法进行联合建树，结果显示根腐病病原菌(SCGF)与木贼镰孢菌(F. equiseti)聚在一支(图 3)，确定该地区番茄根腐病的致病菌为木贼镰孢菌(F. equiseti)。
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平板对峙结果显示，12种生防菌对番茄根腐病有抑制效果，其中SC-6的抑菌效果最好，抑菌半径可达14.00 mm，抑菌率可达56.00%(表 1)。
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结果显示，生防菌株SC-6在9种培养基上均生长良好(图 4)。在不同培养基上培养，产孢和产色素的情况有一定差别，在高氏一号培养基上菌丝呈浅粉色；在ISP1培养基上生长最好，气生菌丝丰茂，单菌落圆形、扁平，产生大量浅黄色可溶性色素(表 2)。
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结果显示，生防菌株SC-6可以利用大多数碳源和氮源，不能利用阿拉伯糖、半乳糖和麦芽糖；能产生淀粉水解酶、接触酶和脲酶；能产生硫化氢和黑色素；可以使牛奶凝固和胨化；生长范围：pH值为5~10，温度为10~45 ℃(表 3)。
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扫描电镜下，生防菌株SC-6基内菌丝和气生菌丝具有典型的链霉菌属特征，其孢子丝连续微卷，孢子杆状，表面光滑(图 5)。
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将测序结果在NCBI上比对，结果显示，菌株序列与白网链霉菌(Streptomyces albireticuli)有较高的相似度。基于16S rDNA基因序列构建系统发育树，结果显示SC-6与白网链霉菌(S. albireticuli)聚在一支上(图 6)。经形态学和分子生物学鉴定，将SC-6鉴定为白网链霉菌(S. albireticuli)。
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由表 4可知，生防菌株SC-6发酵液对番茄幼苗生物量的影响由大到小依次为100倍液、1 000倍液、10倍液。整体上看，生防菌株SC-6发酵液处理后的番茄幼苗相关生长性状明显优于对照处理，说明该菌能够促进番茄幼苗的生长，其中100倍液处理过的幼苗生长优于其他处理，即生防菌株SC-6发酵液100倍液的促生效果最好(图 7)，其株高、根长、地上鲜质量和地下鲜质量分别增加了60.41%、81.84%、176.19%和42.22%。
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盆栽试验结果表明，生防菌株SC-6和化学药剂(甲霜恶霉灵)处理均可显著降低番茄根腐病的病情指数及发病率，其中SC-6处理后的防效为50.02%，接近化学防效(图 8和表 5)。
2.1. 番茄根腐病的分离结果
2.2. 番茄根腐病的鉴定结果
2.2.1. 形态学鉴定
2.2.2. 分子生物学鉴定
2.3. 生防链霉菌的筛选结果
2.4. 生防链霉菌SC-6的鉴定结果
2.4.1. 培养特征观察
2.4.2. 生理生化指标测定
2.4.3. 形态特征观察
2.4.4. 分子生物学鉴定
2.5. SC-6发酵液对番茄幼苗生物量的影响
2.6. SC-6发酵液对番茄根腐病的防治效果
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番茄根腐病是由多种病原真菌侵染引起的，目前已报道的番茄根腐病的病原菌主要有以尖孢镰刀孢(F. oxysporum)为主的镰孢菌[3]，还包括立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)[17]、腐霉菌(Pythium aphanidermatum)[18]、疫霉根腐菌(Phytophthora sojae)[16]等。本研究从陕西省咸阳市番茄根腐病发生严重的地块采集典型病株，分离出1株病原菌，综合形态学和分子生物学鉴定首次确定该地区番茄根腐病的致病菌为木贼镰孢菌(F. equiseti)，该菌种在西北干旱半干旱地区的致病性报道尚属空白。
白网链霉菌(S. albireticuli)虽目前研究较少，仅有的报道也能充分说明其在生物防治方面的巨大潜力。白网链霉菌最早报道于1955年[19]，其后张宁等[20]通过对峙实验发现白网链霉菌(S. albireticuli)ZX-10-4具有拮抗茄子黄萎病病原菌(Verticillium dahliae)的生物活性，10倍发酵液的治疗效果为43.76%。本研究筛选出1株白网链霉菌SC-6，对番茄根腐病盆栽防效达50.02%，与化学药剂相当且优于已有报道。Wang等[21]发现白网链霉菌S. albireticuli MDJK11具有促进植物生长的作用，本研究发现白网链霉菌SC-6能显著促进番茄幼苗的生长，SC-6发酵液100倍液处理后番茄幼苗的株高、根长、地上鲜质量和地下鲜质量分别增加了60.41%、81.84%、176.19%和42.22%。其促生效应可能与分泌吲哚乙酸(IAA)或嗜铁素等代谢物相关，需要进一步探究。王艺茹等[22]发现多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa) HP8-1对番茄疫霉根腐病具有明显的防治效果(57.41%)。Wang等[21]混合培养白网链霉菌MDJK11和白黄链霉菌MDJK44相对于单独培养具有更好的抗镰刀菌效果。本研究SC-6的皿内抑菌率为56.00%，盆栽防效(50.02%)虽然显著，但仍有较大提升空间，未来可通过与芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或其他链霉菌复配，利用协同效应进一步增强田间防效。