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羊肚菌(Morchella spp.)又名羊肚菜、羊肚子、蜂窝蘑、美味羊肚菌、阳雀菌，是羊肚菌科羊肚菌属所有种类的总称，隶属菌物界(Fungi)、子囊菌门(Ascomycota)、盘菌纲(Discomycetes)、盘菌亚纲(Pezizomycetidae)、盘菌目(Pezizales)、羊肚菌科(Morchellaceae)、羊肚菌属(Morchella)[1].羊肚菌是一类药食两用的野生大型真菌，李时珍的《本草纲目》中有其“味甘，寒，无毒，益肠胃，化痰理气”[2]的记载.传统中医认为，羊肚菌能益肠胃，化痰理气，治疗消化不良.近代药理研究发现，羊肚菌还具有保护肝脏[3]、肾脏[4]、抗衰老[5]、抗肿瘤[6]、降血脂[7]和免疫调节作用[8]，因此，羊肚菌是一种不可多得的滋补食材.
如今国内外对于羊肚菌的研究较为广泛，从羊肚菌的菌种分离、纯化、栽培、深加工到产品开发等都有报道.目前报道的羊肚菌菌株分离方法主要有孢子分离、组织分离及基质分离，由孢子分离得到的菌种纯度可靠[9]，并且孢子分离萌发率较组织分离的萌发率更高[10]，而采用组织分离和基质分离的方法分离成功率低，污染率高[11].孢子分离法明显优于其他方法，但分离过程仍然存在部分污染问题.羊肚菌菌丝体形态多样，从同一试管中转接的菌落形态也存在差异性，菌种存在不稳定性[12].羊肚菌菌丝体的生长和菌核的形成是子实体产生的关键，形成菌核是羊肚菌的一个重要特征[13-14].菌核是菌丝体反复进行分枝和菌丝接合交织在一起的组织，共同形成的致密且坚硬的特殊结构[15]，是羊肚菌子实体形成的必经阶段[16]，不同羊肚菌种所形成的菌核，在大小、形状、颜色、数量上存在很大的遗传差异性[17]；同一种菌株在不同培养条件下，菌核差异性也较大.因此菌核是菌种筛选、培养和栽培过程中研究的关键参考指标.国内20世纪70年代初引入羊肚菌人工栽培技术，开始探讨羊肚菌的人工化栽培[18].目前羊肚菌栽培方式多样，主要有大田[19]、林下[20]和箱栽技术[21].但是，3种栽培模式都是以3大技术作为支撑：即以品种技术为基础，外源营养袋技术为核心，栽培管理技术为桥梁.在实际栽培生产中，存在大田出菇不稳定和室内栽培不出菇的状况[22].从市场发展角度来看，目前我国对于羊肚菌的栽培技术并不完全成熟[23].羊肚菌对生长环境的温度、湿度、光照、氧气、pH均有比较苛刻的要求[24]，加之栽培用地、田间管理、病虫害防治很大程度上影响着羊肚菌的产量和品质，故而成熟的羊肚菌栽培技术仍在探索中.筛选合适的羊肚菌培养条件，对提高羊肚菌分离纯化效果、羊肚菌出菇稳定性以及羊肚菌栽培具有重要意义.本文通过研究不同的碳源、氮源、无机盐以及pH对羊肚菌菌丝体生长状况的影响，筛选出更适合羊肚菌的培养条件，最大限度地提高羊肚菌菌丝体生长及菌核形成的能力，为羊肚菌人工栽培的最适生长条件提供数据参考，有助于羊肚菌的规模化人工栽培.
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供试菌株为黑脉羊肚菌(重庆市璞琢农业开发有限责任公司).
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培养基Ⅰ：葡萄糖20 g，蛋白胨2 g，磷酸二氢钾0.5 g，硫酸镁0.5 g，琼脂25 g，蒸馏水1 000 mL.
培养基Ⅱ：葡萄糖20 g，蛋白胨2 g，琼脂25 g，蒸馏水1 000 mL.
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正置荧光显微镜：NIKON公司；HWS智能恒温恒湿保温箱：宁波东南仪器有限公司；JA2003电子天平：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；自动蒸汽消毒锅：上海善志仪器设备有限公司；超净工作台：广州市深华生物技术有限公司.
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将培养基Ⅰ作为碳源试验的基础培养基，分别用20 g的乳糖、半乳糖、山梨醇、果糖、海藻糖、甘露醇、糊精、木聚糖、棉子糖共9种碳源，替换培养基Ⅰ中的20 g葡萄糖，同时，把不加碳源的培养基作为对照(CK)，制作成11种培养基(含CK)，即为11个处理的碳源试验，每个处理设置3次重复.
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将培养基Ⅰ作为氮源试验的基础培养基，分别用0.02，0.2，2 g的酵母浸膏、亚硝酸钠、氯化铵、硫酸铵、尿素和过硫酸铵(0.02，0.002 g)共6种氮源，替换培养基Ⅰ配方中的2 g蛋白胨，同时，以不加氮源作为对照(CK)，分别制作成21种平板培养基，即为21个处理(含CK)的氮源试验，每个处理设置3次重复.
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培养基Ⅱ作为无机盐试验的基础培养基，分别加入300，500，700 mg的磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钠和碳酸钾于培养基Ⅱ中，加入10，30，50 mg的氯化钴、硫酸锌、硫酸铜、硫酸镁于培养基Ⅱ中，以不加任何无机盐的培养基Ⅱ作为对照(CK)，分别制作成25种平板培养基，即为25个处理(含CK)的无机盐试验，每个处理设置3次重复.
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将培养基Ⅰ作为pH试验的基础培养基，用1% NaOH和1% HCl调节培养基pH值为5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，分别制成6种平板培养基，即为6个处理的pH试验，每个处理设置3次重复.
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通过把单因素筛选出来的最好条件与基础培养基Ⅰ进行对比，观察菌丝生长速度、菌丝密度以及菌核的形成，筛选出黑脉羊肚菌生长的最佳组合.
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采用直径为100 mm的培养皿，每个培养基用量25 mL，无菌操作，于皿中央处接种一块直径大约为5 mm的菌饼，在湿度为(45±1)%，温度为(22±1) ℃的培养箱中避光培养.以菌丝刚好延伸至平皿边缘时记录其生长时间，以接种菌饼中心到菌丝生长最远距离为半径，测定菌丝生长速度，观察菌丝的密度和菌核生长情况.
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实验数据用SPSS 20，GraphPad Prism 5等进行分析处理.
1.1. 供试菌株
1.2. 培养基
1.3. 试验仪器
1.4. 试验设计
1.4.1. 碳源试验
1.4.2. 氮源试验
1.4.3. 无机盐试验
1.4.4. pH试验
1.4.5. 验证试验
1.5. 试验方法
1.6. 数据分析
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不同时间的羊肚菌菌落形态见图 1.
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羊肚菌显微观察见图 2.
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碳源是微生物生长的一类营养物，主要作用是为微生物生长代谢提供细胞的碳架，提供细胞生命活动所需的能量，为微生物或细胞的正常生长、分裂提供物质基础.本试验选择了10种质量浓度为2%的不同碳源，结果表明：在不同的碳源培养条件下菌丝都能生长，但是生长状况存在统计学意义，并且浓密程度亦存在明显的统计学意义.其中，在以2%的葡萄糖、海藻糖、乳糖、甘露醇、半乳糖和糊精为碳源的培养基上，菌丝日均生长速度更快；在以2%的木聚糖为碳源的培养基上，菌丝日均生长速度最慢；同时，在以2%的葡萄糖为碳源的培养基上，菌丝生长密度最高，海藻糖、半乳糖棉子糖和糊精密度次之；葡萄糖、甘露醇菌核形成情况较好，见表 1，图 3.
综合试验结果表明：不同碳源对羊肚菌菌丝生长速度和菌丝致密度有不同程度的影响，在以2%的葡萄糖为碳源的培养基上，羊肚菌菌丝生长状况最好.所以2%的葡萄糖是黑脉羊肚菌生长的最适碳源.
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氮源是能提供给微生物细胞组成成分或代谢产物中的氮素来源的营养物质，是合成蛋白质、核酸的重要原料，在细胞代谢中起着至关重要的作用.本试验选择不同的氮源，每种氮源设计了3个不同的浓度，试验结果表明：菌丝都能够生长，生长速度有统计学意义，并且浓密程度亦存在明显的统计学意义.其中在以0.2 g/L尿素，0.2 g/L硫酸铵，0.2 g/L亚硝酸钠，2 g/L亚硝酸钠，0.2 g/L过硫酸铵，2 g/L蛋白胨为氮源的培养基上，菌丝日均生长速度更快；在以2 g/L尿素为氮源的培养基上，菌丝日均生长速度最慢；同时在以2 g/L酵母浸膏，0.2 g/L过硫酸铵，2 g/L蛋白胨为氮源的培养基上，菌丝生长更为浓密，见表 2，图 4.
综合试验结果表明：不同氮源对羊肚菌菌丝生长速度有不同程度的影响，在以2 g/L蛋白胨为氮源的培养基上，羊肚菌生长状况最好，故黑脉羊肚菌的最适氮源为2 g/L蛋白胨.
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无机盐在菌丝生长过程中起到不可或缺的作用.试验选择了8种不同的无机盐，每种无机盐分别设置3个浓度梯度.结果表明：不同的无机盐及浓度对菌丝生长状况有不同的影响，其中，在以MgSO4为无机盐的培养基上，菌丝日均生长速度最快；但差异并无统计学意义；以MnSO4为无机盐的培养基上，菌丝日均生长速度次之.以CuSO4，ZnSO4，CoCl2，K2CO3，NaCl，KH2PO4为无机盐的培养基上，菌丝生长有显著性抑制作用，见表 3，图 5-7.
综合试验结果表明：单一的无机盐对菌丝生长没有显著的促进作用，但存在明显的抑制作用.需进一步试验，来筛选出最适菌丝生长的无机盐组合.
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把2.4.1中几种生长状况较好的无机盐进行组合试验，见表 4.
结果表明：在几种组合的无机盐培养基上，菌丝日均生长速度均无统计学意义，也无显著协同作用.但通过菌丝致密度观察，发现组别3菌丝密度最大，相比之下，组别3更适宜羊肚菌的生长，见表 5，图 8.
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pH是指溶液中氢离子的总数和总物质量的比.反应环境中的H+浓度，pH值小于7，呈酸性；pH值大于7，呈碱性. pH对微生物生长的影响主要是影响微生物体内酶的活性.在本次试验中，不同pH值之间菌丝日均生长速度差异无统计学意义，当pH值在8.0时菌丝生长密度较低，其余pH条件下菌丝生长状况均较好.综合比较，当pH值在6.0时黑脉羊肚菌生长最好，为最适pH，见表 6.
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通过单因素筛选出的最佳条件与基础培养基Ⅰ对比，发现菌丝生长速度差异并无统计学意义，且菌核形成也无明显区别；但通过观察菌丝致密度，发现组别2最致密.综上所述，选择组别2为黑脉羊肚菌生长的最佳组合，见表 7，表 8.
2.1. 羊肚菌生长形态观察
2.1.1. 在碳源培养基上培养不同时间的羊肚菌生长形态观察
2.1.2. 在正置荧光显微镜下培养不同时间观察羊肚菌的生长状况
2.2. 碳源对羊肚菌菌丝生长状况的影响
2.3. 氮源对羊肚菌菌丝生长状况的影响
2.4. 无机盐对羊肚菌菌丝生长状况的影响
2.4.1. 单因素试验
2.4.2. 无机盐组合试验
2.5. pH对黑脉羊肚菌菌丝生长状况的影响
2.6. 验证试验
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试验中观察到黑脉羊肚菌生长的一系列变化.首先是羊肚菌菌种在培养基上形成菌丝，包括气生菌丝和基内菌丝.基内菌丝是生长在培养基内或基料内的营养菌丝，可以产生各种胞外酶类、水溶性和脂溶性色素等，使培养基着色.气生菌丝是由基内菌丝生长出培养基外伸向空间的菌丝，呈直生或分支状.随着培养时间的增加，气生菌丝上有明显的水珠产生，菌丝形态和产生的位置开始发生变化，主菌丝开始分支，分支菌丝和主菌丝之间相互融合交织形成菌丝网格，培养基颜色发生变化，同时菌丝扭结形成菌核，菌核逐渐生长成熟，并且菌核在羊肚菌生长史上起着重要的作用[16].
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在碳源试验中发现，不同碳源对黑脉羊肚菌菌丝体及菌核的生长有不同的效果.其中，以在2%葡萄糖培养基上生长最好，是黑脉羊肚菌的最适碳源，与赵春燕等[25]、彭路等[26]研究的最适碳源为葡萄糖结论一致，与董雪[27]研究的最适碳源是可溶性淀粉和麦芽糖有所不同.由于本试验并没有用可溶性淀粉和麦芽糖来做碳源试验，故不能直接比较与葡萄糖的效果，后续可继续进行研究.
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在氮源试验中发现，氮源会对黑脉羊肚菌菌丝体及菌核的生长产生影响，本次试验表明，黑脉羊肚菌的最适氮源为2 g/L的蛋白胨，与彭路等[26]、陈芳草等[28]、谢放等[29]研究的最适为0.4%的蛋白胨浓度略有不同，与刑增涛等[30]研究的0.4%胰蛋白胨也有差异，这可能由于菌种及培养方式不同引起，后续可开展浓度筛选和比较试验.
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在无机盐试验中发现，不同无机盐对黑脉羊肚菌菌丝体及菌核的生长有不同的效果，且作用效果相差较大.以MnSO4和MgSO4为无机盐的培养基上羊肚菌生长较好，MgSO4促进作用更强，与李洁等[31]研究的MgSO4能够促进羊肚菌孢子萌发和菌丝生长的结果一致，与刘生梅[32]研究的Zn，Cu等微量元素对羊肚菌生长有促进作用结果不一致，且本试验表明，Zn，Cu等微量元素对黑脉羊肚菌生长有抑制作用，可能是由于羊肚菌的种类不同而导致的结果不同.
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羊肚菌和其他真菌类似，具有一个较宽的pH范围，根据陈易飞等[33]的研究，羊肚菌在pH值为3.5~10的范围内均能生长，pH值为5.5~8.7时生长状态良好.本试验发现，pH值为5.5~8.0菌丝生长良好，最适pH值为6.0，菌丝日均生长速度差异无统计学意义，与陈芳草等[28]研究的最适pH值在5~8，陶热等[34]的最适pH值为6相一致.与陈易飞等[33]研究苏州产羊肚菌菌丝体最适pH值为7.7结果不一致，这可能是由于羊肚菌的种类不同所至.
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通过将单因素筛选出的最佳碳源、氮源和无机盐进行组合试验，发现在2%海藻糖，2 g/L蛋白胨，0.005%MnSO4，0.05%KH2PO4和0.07%MgSO4组合的培养基上，黑脉羊肚菌生长状况最佳，与基础培养基相比，促进了羊肚菌菌丝体的生长，提高了菌丝密度和加快了菌核的形成，有利于子实体的产生.