白萝卜购自中国重庆市北碚区永辉超市。4种泡菜盐购自重庆市盐业有限公司。泡菜盐中钙离子含量分别为459、510、892、1 350 mg/kg，并且将实验组分别命名为T459、T510、T892、T1350；对照组采用新鲜白萝卜，命名为C0组。

氯化钠、柠檬酸钠、硼氢化钠、二甲基亚砜、丙酮、乙酸：分析纯，重庆川东化工有限公司；乙酸钠、柠檬酸、果胶、半乳糖醛酸、咔唑、氯仿：分析纯，上海麦克林生化科技有限公司；硝酸：分析纯，福州韦伯康生物科技有限公司；葡萄糖：分析纯，常德比克曼生物科技有限公司；反式-1，2-环己二胺四乙酸：分析纯，天津市众联化学试剂有限公司；蒽酮：分析纯，上海科丰实业有限公司；甲苯胺蓝O：分析纯，北京伊诺凯科技有限公司；多聚半乳糖醛酸、水杨苷：分析纯，南京草本源生物科技有限公司；3，5-二硝基水杨酸：化学纯，成都市科龙化工试剂厂；碳酸钠、氢氧化钠、硫酸：分析纯，成都市科龙化工试剂厂；无水氯化钙、羟甲基纤维素钠：分析纯，成都市科隆化学品有限公司。

CT325K230物性测定仪，美国Brookfield公司；DDS-309+电导率仪，成都方舟科技有限公司；biotek/H1MG酶标仪，美国BioTek公司；TU-1950双光束紫外可见分光度计，北京普析通用仪器有限公司；TAS-990AFG火焰石墨炉一体原子吸收分光光度计，北京普析通用仪器有限公司；BX43正置显微镜，美国奥林巴斯公司；HH-4恒温水浴锅，常州澳华仪器有限公司；5810台式高速离心机，德国Eppendorf公司。

将新鲜白萝卜清洗沥干后切分成长、宽25 mm，厚10 mm的块状，加入含量为4%的泡菜盐预腌2 h，再加入含量为2%的盐水(菜、水体积比为1∶2)混合装坛后，接种乳酸菌发酵(植物乳植杆菌接种量为1×10⁹ CFU/mL，肠膜明串珠菌接种量为1×10⁷ CFU/mL)，在25 ℃恒温条件下密封发酵。取发酵成熟的泡萝卜样品用于指标测定。

参考文献[10]的方法。取长、宽25 mm，厚10 mm泡萝卜样品置于质构仪下进行质构测定。质构测定参数：探头TA44，测试速率1 mm/s，下降距离为5 mm，压缩力7 g。实验重复3次。

参考文献[11]的方法。细胞膜渗透率为煮沸后与煮沸前电导率之比所得到的相对电导率。实验重复3次。

参考文献[12]的方法。用1 mol/L氯化钠溶液提取后定容到100 mL，用原子吸收分光光度计测定果胶酸钙含量。原子吸收分光光度计元素测量参数：工作灯电流3.0 mA、光谱带宽0.4 nm、负高压300.0 V、燃气流量1 700 mL/min、燃烧器高度6.0 nm。实验重复3次。

醇不溶性物质(alcohol insoluble residue，AIR)的提取参考文献[13-14]的方法，略有修改。用咔唑比色法测定水溶性果胶、螯合剂可溶性果胶、碳酸钠可溶性果胶的含量。以葡萄糖为标准品，用蒽酮硫酸法测定纤维素、半纤维素含量。实验重复3次。

参考文献[15]的方法。果胶甲酯酶活性、多聚半乳糖醛酸酶活性、β-葡萄糖苷酶活性、纤维素酶活性的测定采用3，5-二硝基水杨酸(DNS)法。酶活性被量化为在37 ℃下每小时每克萝卜样品水解底物产生1 mg相应还原糖量。酶活性单位表示为U。实验重复3次。

参考文献[16]的方法。将萝卜样品切成薄片，在0.5 g/L甲苯胺蓝O溶液中染色5min，冲洗沥干后在正置显微镜下观察，并采集图像进行分析。实验重复3次。

使用Microsoft Office Excel统计并处理数据。使用SPSS 21.0的ANOVA法对数据进行单因素方差分析。使用Origin 2021绘图。

质构是评价泡萝卜品质的重要指标之一^[17]，本研究选取硬度和咀嚼性2个指标分析样品质构特性的变化。如图 1a所示，4个实验组泡萝卜的硬度显著高于对照组(p＜0.05)，其中T510组泡萝卜的硬度显著高于其他实验组(p＜0.05)。随着泡菜盐中钙离子含量的增加，泡萝卜硬度的增加量呈先上升后下降的趋势，最后趋于平稳。这是由于钙离子含量较低时，钙离子能与果胶酸形成果胶酸钙，细胞壁间的黏附性增强，硬度提高；钙离子含量较高时，萝卜细胞组织过度硬化，导致细胞失水，使其硬度下降；除此之外，钙离子还会增加发酵液的渗透压，使细胞失水^[18]。继续增加钙离子含量不再对萝卜细胞组织硬化和萝卜细胞内外渗透压造成影响，导致硬度不变。有研究发现，不同质量分数氯化钙浸泡对青椒硬度的差异有统计学意义(p＜0.05)，随着氯化钙使用量的增加，硬度先逐渐上升后下降^[19]，这与本研究结果类似。如图 1b所示，发酵后各个实验组泡萝卜的咀嚼度均降低，其中T459组泡萝卜咀嚼度最低，为(1.1±0.14)mJ，但与T510组和T892组的差异无统计学意义(p＞0.05)。

如图 1c所示，4个实验组的细胞膜渗透率显著高于对照组(p＜0.05)，这一现象可能归因于盐渍处理对萝卜细胞造成的逆境压力，导致细胞膜结构受损，使得细胞内的电解质物质外泄，从而增加了萝卜细胞浸提液的电导率，导致细胞膜渗透率的增加^[20-22]。有研究发现，用氯化钙处理西梅果实能够延缓细胞膜渗透率的上升，且不同浓度氯化钙的延缓程度不同^[23]，但本研究结果与此不同，可能是因为盐渍处理对细胞膜渗透率的影响远大于钙对其的影响，所以不同钙离子含量盐发酵萝卜细胞膜渗透率之间的差异无统计学意义(p＞0.05)。

钙离子与果胶酸生成不溶于水的果胶酸钙凝胶，在细胞间隙起到粘连细胞的作用，防止细胞解体，从而达到保脆的目的^[24-26]。如图 1d所示，4个样品实验组果胶酸钙含量显著高于对照组(p＜0.05)，其中T510组果胶酸钙含量最高，显著高于T892组和T1350组(p＜0.05)，但与T459组的差异无统计学意义(p＞0.05)。随着钙离子含量增加，果胶酸钙含量呈先上升后下降，最后趋于稳定的趋势，这是因为钙离子含量较高时，萝卜组织过度硬化，并且钙离子含量过高增加发酵液的渗透压，导致细胞失水^[18]，从而引起样品表皮皱缩、软化等质地改变^[27]，同时也带动了果胶酸钙含量的变化，使得果胶酸钙含量有所下降。有研究发现，大头菜中果胶酸钙含量随着氯化钙浓度的上升，整体呈现先上升后下降的趋势^[28]，这与本研究结果类似。

果蔬细胞壁中的果胶与纤维素是影响果蔬硬度的重要物质，果胶与纤维素交叉联接，对细胞起支撑作用，有利于保持细胞壁结构^[29]。根据果胶的溶解特性可将其分为水溶性果胶、螯合剂可溶性果胶和碳酸钠可溶性果胶^[30]。如图 2a所示，T510组果胶含量显著高于其他组(p＜0.05)。不同钙离子含量盐发酵泡萝卜中果胶相对含量如图 2b所示，发现经不同钙离子浓度盐发酵的萝卜与对照组相比，螯合剂可溶性果胶相对含量显著下降(p＜0.05)，碳酸钠可溶性果胶相对含量显著上升(p＜0.05)，这可能是因为泡萝卜在发酵过程中螯合剂可溶性果胶转化成了碳酸钠可溶性果胶。如表 1所示，T510组的水溶性果胶含量显著低于其他组(p＜0.05)，C0组的水溶性果胶含量显著高于其他组(p＜0.05)。有研究发现，猕猴桃的水溶性果胶含量随着储藏时间延长呈现明显升高趋势，而螯合剂可溶性果胶含量及碳酸钠可溶性果胶含量迅速下降，并伴随着猕猴桃质地软化^[31]；CaCl₂处理可以抑制青椒储藏期间果胶的降解，减缓水溶性果胶含量的增加^[32]。表 1还说明，每组螯合剂可溶性果胶含量均显著高于同组的水溶性果胶含量，且显著低于碳酸钠可溶性果胶含量(p＜0.05)，其中T510组的碳酸钠可溶性果胶含量显著高于其他组(p＜0.05)。这是因为钙离子可以抑制果胶酶类活性位点的暴露，降低果胶酶的活性，阻止螯合剂可溶性果胶及碳酸钠可溶性果胶向水溶性果胶进行转化。

如图 2c和图 2d所示，4个样品实验组的纤维素含量和半纤维素含量均显著高于对照组(p＜0.05)，其中T510组的含量显著高于其他组(p＜0.05)，在半纤维素与纤维素含量检测中，其余3个样品实验组的差异无统计学意义(p＞0.05)，进一步证实T510组在保脆效果上的优势。

果实质地软化和细胞壁降解酶的活性息息相关，当细胞壁中的果胶受到果胶酶和酸的作用时，就会逐渐水解为可溶性果胶酸，使细胞壁中胶层溶解，细胞间黏合力下降，从而引起蔬菜质地软化^[33-34]。果胶甲酯酶、多聚半乳糖醛酸酶、β-葡萄糖苷酶、纤维素酶为细胞壁降解的主要相关酶。如图 3a所示，T510组果胶甲酯酶活性显著低于其他组(p＜0.05)，这表明钙离子含量达到一定程度时，在果胶甲酯酶的作用下，果蔬组织中低甲氧基果胶和钙离子结合形成钙桥，使果蔬的纤维-果胶网络结构更加牢固，从而增强其硬度^[35]。同时，其他3个样品实验组间的果胶甲酯酶活性的差异无统计学意义(p＞0.05)，这再次证实T510组在保脆效果上的优势。

多聚半乳糖醛酸是细胞壁多糖的重要成分，多聚半乳糖醛酸酶可水解多聚半乳糖醛酸的1，4-α-D-半乳糖苷键，破坏细胞壁结构，分解果胶从而导致果实软化^[36]。如图 3b所示，T1350组泡萝卜的多聚半乳糖醛酸酶活性最低，但与T510组和T892组差异无统计学意义(p＞0.05)，这种现象可能与不同浓度外源钙处理影响酶活性峰值出现时间有关^[37]。β-葡萄糖苷酶属于聚糖水解酶类，能与纤维素酶协调作用，主要水解非还原性末端的β-D-糖苷键生成β-D-葡萄糖^[38]。如图 3c所示，T510组与T892组泡萝卜中的β-葡萄糖苷酶活性差异无统计学意义(p＞0.05)，但显著低于C0组、T459组和T1350组(p＜0.05)。在果实成熟软化过程中，纤维素酶活性升高，表明纤维素酶降解果实细胞壁中的纤维素，导致细胞壁组织的解聚、溶解及果实的软化^[39]。如图 3d所示，T510组泡萝卜的纤维素酶活性显著低于其他组(p＜0.05)。如图 3所示，4种细胞壁降解酶中β-葡萄糖苷酶的活性最高，表明泡萝卜的质地软化可能主要受到β-葡萄糖苷酶的影响。T510组泡萝卜中4种细胞壁降解酶活性均较低，反映出其在泡萝卜保脆方面具有积极作用。同时，对照组与4个样品实验组之间的差异有统计学意义(p＜0.05)，表明不同钙离子含量盐发酵对降低泡萝卜细胞壁降解酶活性具有显著影响。

在加工储藏和运输过程中，果蔬的细胞结构易发生改变，导致细胞膜、细胞壁以及由果胶质构成的中胶层被破坏而收缩、坍塌^[40]。图 4为样品实验组和对照组萝卜细胞的微观结构(为了显示不是偶然现象，每组进行平行实验，放两个图)。可以看出，C0组萝卜组织细胞排列无规则，细胞结构紊乱无秩序；不同钙离子含量盐发酵处理的泡萝卜样品组织细胞排列较为紧密、整齐，说明钙离子与果胶酸形成的果胶酸钙在细胞壁之间起到了一定的粘连细胞的作用，对泡萝卜的细胞壁组织起到一定的支撑作用，再次证明钙离子利于维持果蔬细胞壁结构的完整性和泡萝卜的脆度。

泡萝卜的各项指标与硬度之间存在着紧密的联系，对本研究中测定的13个指标进行相关性分析。如图 5所示，硬度与细胞膜渗透率、果胶酸钙含量、碳酸钠可溶性果胶含量、纤维素含量、半纤维素含量呈显著正相关(p＜0.05)，与水溶性果胶含量、4种细胞壁降解酶活性呈显著负相关(p＜0.05)；细胞壁降解酶活性与水溶性果胶含量呈显著正相关(p＜0.05)，与细胞膜渗透率、果胶酸钙含量、纤维素含量、半纤维素含量、碳酸钠可溶性果胶含量呈显著负相关(p＜0.05)，说明细胞壁降解酶活性升高会使细胞膜渗透率、果胶酸钙含量、纤维素含量、半纤维素含量减少，导致果实软化。本研究中不同钙离子含量盐发酵萝卜后使得其中的细胞壁降解酶活性降低，从而引起其他指标变化，最终导致泡萝卜硬度增加。

本研究通过测定不同钙离子含量盐发酵萝卜的质构特性、细胞壁降解酶活性、细胞微观结构等指标并进行相关性分析，研究不同钙离子含量盐对泡萝卜脆度的影响。研究发现，泡菜盐中不同钙离子含量对泡萝卜的质构特性、果胶酸钙含量、纤维素含量、半纤维素含量、细胞壁降解酶活性、细胞微观结构均有显著影响(p＜0.05)，但对泡萝卜的细胞膜渗透率无显著影响(p＞0.05)。钙离子含量的适当增加可以提高泡萝卜中果胶酸钙的含量，达到增加泡萝卜硬度的效果，但其对果胶酸钙的影响存在一个最优含量，超过该含量后硬度会下降。细胞壁多糖方面，T510组的水溶性果胶含量最低，碳酸钠可溶性果胶含量最高，而4个样品实验组碳酸钠可溶性果胶含量均显著高于同组的水溶性果胶含量、螯合剂可溶性果胶含量(p＜0.05)，并且纤维素含量、半纤维素含量均显著高于新鲜萝卜(p＜0.05)，这说明不同钙离子含量盐发酵泡萝卜具有良好的保脆效果。不同钙离子含量盐发酵对泡萝卜的酶活性具有调节作用，能够降低泡萝卜中细胞壁降解酶的活性，减少果胶降解，抑制软化，保持泡萝卜的脆度。其中T510组果胶甲酯酶活性、纤维素酶活性、β-葡萄糖苷酶活性显著低于其他组(p＜0.05)。不同钙离子含量盐发酵可促进泡萝卜的细胞排列秩序性，从而保持泡萝卜的脆度。相关性分析表明，细胞壁降解酶活性与水溶性果胶含量呈显著正相关(p＜0.05)，与细胞膜渗透率、果胶酸钙含量、纤维素含量、半纤维素含量、碳酸钠可溶性果胶含量呈显著负相关(p＜0.05)。综上所述，本研究发现泡菜盐中钙离子含量为510 mg/kg时发酵泡萝卜在保脆效果上表现最佳。