榨菜原料(青菜头)购自重庆市涪陵区某农户。

正十五烷-d32：分析纯，上海麦克林生化科技股份有限公司；正构烷烃混标(C10-C25)：标准品，LGC集团公司；MagAtrract PowerSoil Pro DNA Kit：试剂盒，德国凯杰(qiagen)生物公司；快速Pfu聚合酶：扩增速度4 kb/min，北京全式金生物技术有限公司。

气相色谱-质谱联用仪：7697A-8890-7000D，安捷伦科技有限公司；PCR仪：T100 Thermal Cycler，美国BIO-RAD公司；电泳仪：JY600C，北京君意东方电泳设备有限公司。

新鲜青菜头去筋。一盐用盐量4%(质量比)，在塑料大桶一层菜一层盐腌制15 d后，捞起青菜头，倒掉废盐水；二盐再补加盐量5%(质量比)，在塑料大桶一层菜一层盐腌制，于25 ℃密封发酵。补加二盐后第0、4、8、12、16个月取样，每次取腌制桶上、中、下层样品混合，依次记为ZX4_0、ZX4_4、ZX4_8、ZX4_12、ZX4_16。

参照文献[13]的测序方法稍作修改。根据微生物群落总基因组DNA试剂盒提取样品总DNA，采用引物338F_806R和IT1F_IT2R，扩增细菌16S rRNA基因V3-V4可变区、真菌的ITS-V1区。采用Illlumina MiSeq平台和MiSeq Reagent Kit v3进行双端2×250 bp测序，测序由上海美吉生物医药科技有限公司完成。

参照文献[14]的测序方法稍作修改。取2 g样品置于20 mL顶空瓶，加入内标2.0 μL(正十五烷-d32 100 μg/mL)立即密封顶空瓶。温度80 ℃，平衡20 min，SPME萃取头样品吸附时间20 min，样品解吸时间2 min。

气相色谱条件：毛细管柱为25 m×0.25 mm×0.20 μm(Agilent CP9204)，压力为100.00 kPa。进样口温度240 ℃，载气为高纯氦气，载气流速1.50 mL/min，隔垫吹扫流速3 mL/min，不分流进样。升温程序：初始温度40 ℃，平衡0 min；然后以15 ℃/min的速度升至150 ℃；再以5 ℃/min的速度升至230 ℃，并维持5 min；最后运行230 ℃，维持2 min。

质谱条件：电子轰击离子源(EI)，传输线温度为280 ℃，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，电子能量70 eV。扫描方式为全扫描模式(SCAN)，质量扫描范围为50~500 m/z，扫描频率为3.2 Hz。

每个试验样本设定3个重复，结果以 x±s表示，数据采用SPSS 17.0软件进行处理。用内标法对挥发性风味化合物进行定量，利用Origin软件和美吉生物云平台绘图。微生物群落与挥发性风味物质种类采用皮尔逊(Pearson)相关分析方法，利用R语言绘图。

榨菜发酵过程中微生物群落的丰富度和多样性如表 1所示，随着发酵的进行，细菌Chao1指数、Shannon指数逐渐增大，Simpson指数逐渐减小，说明榨菜细菌的丰富度和多样性程度逐渐增加；真菌Chao1指数和Shannon指数在ZX4_12组达到最大值，说明榨菜发酵至12个月时真菌的丰富度和多样性程度最高，随后真菌丰富度和多样性程度迅速降低，可能是由于发酵后期酸度较高，抑制了部分不耐酸的真菌的生长繁殖，从而造成真菌丰富度和多样性程度降低^[15]。

榨菜样品细菌和真菌稀释曲线(Sobs指数)和Shannon曲线(Shannon指数)如图 1所示，随着序列数的增加，曲线趋于平缓，表明样品测序量充分，足以反映各组榨菜样品情况。

对榨菜发酵过程中样品细菌和真菌的ASV数据进行主坐标分析，研究榨菜样品在组间和组内群落的相似性或差异性，结果如图 2所示。细菌主坐标分析中PC1贡献率为67.83%，PC2贡献率为20.26%；真菌主坐标分析中PC1贡献率为71.03%，PC2贡献率为16.58%，证明图 2具有较好的解释效果。ZX4_0、ZX4_4、ZX4_8组细菌和真菌均处于不同象限，细菌ZX4_12、ZX4_16组处于同一象限，真菌ZX4_12、ZX4_16组处于相邻象限，说明榨菜发酵前期(0到4个月)微生物群落差异较大，中后期(8到16个月)差异较小。其中PC1是影响微生物群落结构的最主要因素的投影方向，PC2是影响微生物群落结构的第二重要因素的投影方向。

榨菜样品在门水平共检测出6个优势细菌门(相对丰度大于1%)，分别为厚壁菌门(Firmicutes)、变形杆菌门(Proteobacteria)、盐厌氧菌门(Halanaerobiaeota)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、弯曲菌门(Campilobacterota)、脱硫杆菌门(Desulfobacterota)。榨菜二盐初期(0个月)厚壁菌门为绝对优势菌门，占比93.96%；随着发酵的进行，厚壁菌门和变形杆菌门成为主要优势菌门，这两个菌门是绝大多数发酵蔬菜的优势细菌门(图 3a)。

榨菜样品在属水平共检测出15个优势细菌属(相对丰度大于1%)，主要为乳杆菌属(Lactobacillus)、盐单胞菌属(Halomonas)、海洋杆菌属(Marinobacter)、盐厌氧菌属(Halanaerobium)、明串株菌属(Leuconostoc)、嗜盐菌属(Salinivibrio)、魏斯氏菌属(Weissella)、色盐杆菌属(Chromohalobacter)、四联球菌属(Tetragenococcus)等。发酵初期(0个月)主要优势菌属为乳杆菌属、明串株菌属和魏斯氏菌属，与泡菜优势菌群一致^[13]，可能是由于榨菜一盐腌制用盐量(质量比4%)与泡菜发酵用盐量较相似，均为低盐发酵，导致细菌属类似，二盐再加5%盐后，随着发酵的进行，乳杆菌属占比由76.24%减少至55.3%，盐单胞菌属占比由0.21%增加至24.13%，明串株菌属(9.24%)和魏斯氏菌属(7.96%)分别减少至2.16%、0.22%。到发酵后期(16个月)主要优势菌属变为乳杆菌属、盐单胞菌属、海洋杆菌属和盐厌氧菌属(图 3b)。有研究表明耐盐菌属为用盐量质量比10%的蔬菜的优势菌属^[16]。乳杆酸菌属作为整个发酵过程的主要优势菌属，对发酵产品风味的形成有重要作用^[17-18]。盐单胞菌属于耐盐菌，能发酵葡萄糖产酸，分泌丰富的酶系，产生多种风味物质，使泡菜风味更饱满^[19]。

在门水平共检测出4个优势真菌门(相对丰度大于1%)，分别为子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、Fungi_phy_Incertae_sedis、unclassified_k Fungi。榨菜发酵初期(0个月)担子菌门为其主要优势菌门，中后期(8到16个月)子囊菌门为主要优势菌门(图 4a)。

在属水平共检测出16个优势真菌属(相对丰度大于1%)，主要为德巴利氏酵母属(Debaryomyces)、白冬孢酵母属(Leucosporidium)、未分类的银耳属(unclassified_c Tremellomycetes)、拟威克酵母属(Wickerhamiella)、嗜盐梗孢酵母属(Sterigmatomyces)、枝孢属(Cladosporium)、unclassified_k_Fungi等。发酵初期(0到4个月)主要真菌属为德巴利氏酵母属、白冬孢酵母属、未分类的银耳属，中后期(8到16个月)主要真菌属为德巴利氏酵母属、拟威克酵母属(图 4b)。白冬孢酵母属主要存在蔬菜表面且嗜冷性极强，其在榨菜发酵早期大量存在，可能与榨菜主要在冬季收获、腌制有关；银耳属在大头菜发酵期也被大量检出^[20]；德巴利氏酵母属和拟威克酵母属主要存在于发酵中后期，其具有一定的耐酸耐盐特性，能利用多种碳源，促进醇类、酯类和其他代谢产物的形成^[21-22]，有利榨菜发酵后期风味的形成。

榨菜发酵过程中挥发性风味物质成分顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用检测结果见表 2，挥发性风味物质成分分类含量和种类数见表 3。

由表 2、表 3所示，共鉴定出120种挥发性风味物质成分，包括酯类33种、醇类16种、酸类12种、有机硫化物类8种、醚类6种、烃类9种、醛类14种、酮类8种、酚类5种、胺类4种、其他类5种。在榨菜整个发酵过程中，挥发性风味物质总含量呈先减少后增加趋势，由689.35 μg/kg下降至405.58 μg/kg再上升至540.28 μg/kg。在发酵初期0个月，主要为有机硫化物类、酯类和醇类；发酵4到8个月，主要为酯类、醇类和酸类；发酵后期12到16个月，主要为酯类、酸类和醇类，其次为醚类、有机硫化物类以及烃类物质。这些物质共同赋予涪陵榨菜独特的风味。

酯类物质作为香气骨架成分，主要由酸类和醇类物质酯化反应产生^[23]。在榨菜整个发酵过程中，酯类物质由113.06 μg/kg(21种)增加至348.22 μg/kg(29种)，是发酵后期的主要风味物质，约占总量的64.45%，其中亚麻酸乙酯、2-甲基己酸甲酯和棕榈酸甲酯含量较高，是榨菜的主要挥发性酯类物质，这与文献[24]的研究结果相似。到发酵末期16个月时，主要增加了乙酸乙酯(苹果香气)、丁酸乙酯(菠萝甜香)、乳酸丙酯(奶油风味)、9-十六烯酸乙酯(花香)、顺-9-十八烯酸丙酯等，能赋予榨菜更多水果香、花香和甜香^[25-26]。

醇类物质的合成途径主要为氨基酸代谢、乳糖代谢、亚麻酸和亚油酸降解，其对酯类、醛类和酮类物质的产生至关重要，是发酵食品风味形成不可或缺的成分^[27]。榨菜醇类物质主要存在于发酵4到8个月，其含量最高85.83 μg/kg，其中2-丙醇、1-辛烯-3-醇、芳樟醇等随着发酵的进行含量逐渐减少，可能是由于其参与了发酵后期的酯化发应^[28]。醇类物质中，异戊醇和正戊醇呈果香、醇香，1-辛烯-3-醇呈蘑菇香，5-降冰片烯-2-醇呈松木香且略带清凉感，苯乙醇具有新鲜面包香、清甜的玫瑰香，其在榨菜发酵中常被检出^[29]。

酸类物质是发酵食品风味形成的重要物质，具有维持和协调香气的作用^[30]。发酵初期0个月，仅检测到草酸和正辛酸，总量38.20 μg/kg(2种)。随着发酵的进行，酸类物质种类和含量逐渐增加，到发酵结束时(16个月)，检测出酸类物质总量64.66μg/kg(11种)，而文献[24]的研究表明，榨菜发酵过程中酸类物质含量逐渐减少，与本研究结果相反，可能与加工工艺和用盐量不同有关。到榨菜发酵后期主要增加了乙酸、正戊酸、正丁酸、棕榈油酸等。

榨菜发酵过程中的有机硫化物类主要为异硫氰酸酯类，异硫氰酸酯类是榨菜原料青菜头辛辣味的主要来源，在榨菜腌制过程中其辛辣味逐渐消失^[31]。在发酵初期0个月，有机硫化物类含量为372.08 μg/kg，占该时期挥发性风味物质成分总量的53.98%，随着发酵的进行，其含量迅速减少，发酵4个月时，其含量仅57.51 μg/kg，到发酵16个月时，为12.63 μg/kg，占总量的2.34%。

随着发酵的进行，榨菜中醚类物质含量逐渐增加，到发酵末期为24.38 μg/kg，其中，丙烯基茴香醚又称茴香脑，是其主要醚类物质，呈鲜茴香、甜香、辛香的口感，对于榨菜形成特有的辛香味具有重要作用^[32]；醛类物质含量和种类数均降低，可能与发酵系统酸度增加和微生物群落的变化有关。烃类、酮类和酚类物质在整个发酵过程中含量和种类数变化不大。

榨菜挥发性风味受原料、微生物和工艺条件等诸多因素的影响，微生物对其挥发性风味物质的形成至关重要。为了研究不同微生物与榨菜挥发性风味物质成分之间的相关性，采用Pearson相关性分析探究了各挥发性风味物质种类和优势微生物菌属(相对丰度排名前10)之间的相关关系，结果如图 5所示。大部分主要细菌属与挥发性风味物质种类呈正相关。乳杆菌属、明串株菌属和魏斯氏菌属与挥发性风味物质种类的相关性较一致，均与榨菜有机硫化物类、醛类、烃类和酚类呈显著正相关(p＜0.05)，其中，与有机硫化物类高度显著正相关(p＜0.001)，而与酯类呈极显著负相关(p＜0.01)。乳杆菌属、魏斯氏菌属常在泡菜以及酒类发酵过程中被检出，与风味的形成密切相关^[33-34]。盐单胞菌属与有机硫化物类、醛类、烃类、酚类呈高度显著负相关(p＜0.001)。海洋杆菌属和盐厌氧菌属均与酯类、酸类以及醚类极显著正相关(p＜0.01)。嗜盐菌属、色盐杆菌属和四联球菌属与醇类呈高度显著正相关(p＜0.001)，与酮类呈显著正相关(p＜0.05)。德巴利氏酵母属作为榨菜发酵中后期的主要优势真菌属，与大部分挥发性风味物质种类呈高度显著负相关(p＜0.001)，文献[35]的研究表明德巴利氏酵母属与豆瓣酱风味呈正相关，这与本文研究结果相反，可能与发酵原料、发酵工艺不一致有关。白冬孢酵母属、枝孢属和癣襄腔菌(Plectosphaerella)属，均与酯类呈高度显著负相关(p＜0.001)，与有机硫化物类、醛类、烃类以及酚类呈高度显著正相关(p＜0.001)；拟威克酵母属与大部分挥发性风味物质种类呈明显负相关，与酯类呈显著正相关(p＜0.05)，与酸类呈极显著正相关(p＜0.01)；嗜盐梗孢酵母与酯类呈高度显著正相关(p＜0.001)。说明榨菜独特风味的形成是由多种微生物共同作用产生。根据实际生产，可通过调节榨菜发酵过程中微生物种类来改善榨菜风味。

采用高通量测序技术和顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术研究了涪陵榨菜发酵过程中微生物群落、挥发性风味物质成分的变化以及两者间的相关性。榨菜发酵初期，主要优势菌属为乳杆菌属、明串株菌属、德巴利氏酵母属和白冬孢酵母属；到发酵中后期，演变为乳杆菌属、盐单胞菌属、海洋杆菌属、德巴利氏酵母属以及拟威克酵母属。发酵过程中共检测到120种挥发性风味物质，主要挥发性风味物质为有机硫化物类、酯类、醇类和酸类，含量较高的风味物质为全异硫氰酸酯、2-甲基己酸甲酯、5-降冰片烯-2-醇、亚麻酸乙酯和草酸。微生物与挥发性风味物质成分相关性表明，优势细菌属与大部分挥发性风味物质种类呈正相关，其中，乳杆菌属、明串株菌属和魏斯氏菌属均与有机硫化物类、醛类、烃类和酚类显著正相关(p＜0.05)；海洋杆菌属和盐厌氧菌属均与酯类、酸类以及醚类极显著正相关(p＜0.01)。嗜盐菌属、色盐杆菌属和四联球菌属与醇类呈高度显著正相关(p＜0.001)。优势真菌属对榨菜风味的形成也至关重要，德巴利氏酵母属与大部分挥发性风味物质种类呈高度显著负相关(p＜0.001)，而白冬孢酵母属、枝孢属、癣襄腔菌属，均与大部分挥发性风味物质种类呈高度显著正相关(p＜0.001)。本研究有助于解析菌群结构对涪陵榨菜风味形成的关系，并为改进榨菜加工工艺及调控产品品质提供了一定理论基础。