新鲜大红袍(古红橘)于2024年1月在重庆市云阳县采摘，经重庆市中药研究院中药生药研究所瞿显友研究员鉴定为新鲜橘(大红袍)。

对照品橙皮苷(纯度＞98%，批号：PS011588)、维采宁-2(纯度＞98%，批号：PS012054)、橘皮素(纯度＞98%，批号：PS012027)、6-去甲氧基橘皮素(纯度＞98%，批号：PS011274)、川陈皮素(纯度＞98%，批号：PS012026)、异橙黄酮(纯度＞98%，批号：PS011270)、甜橙黄酮(纯度＞98%，批号：PS011273)、圣草次苷(纯度＞98%，批号：PS010198)、芦丁(纯度＞98%，批号：DF20D267)，成都普思生物科技股份有限公司；焦性没食子酸(批号：TS0905CA14)、福林酚(批号：S29851)，上海源叶生物科技有限公司；1，1-二苯基-2-2苦基肼(DPPH，批号：1C1895644)、2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS，批号：SLBZ8095)，西格玛奥德里奇贸易有限公司；无水D-(+)-葡萄糖(批号：G61055A)，上海泰坦科技股份有限公司；维生素E(批号：F1624018)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇(色谱纯，批号：40Y2207LC)，美国ACS公司；茚三酮显色液、H型氨基酸混合标准液，日本和光纯药工业株式会社；无水乙醇(分析纯，批号：20220901)、甲醇(分析纯，批号：20240601)，重庆川东化工(集团)有限公司；磷酸(色谱纯，批号：20240701)，天津市科密欧化学试剂有限公司。

Waters高效液相色谱仪，美国沃特世科技有限公司；紫外分光光度计，上海嘉鹏科技有限公司；氨基酸自动分析仪，日本日立公司；台式高速离心机，湖南可成仪器设备有限公司；鼓风干燥机，上海博讯医疗生物仪器股份有限公司；电子天平，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；光吸收全波长酶标仪，上海闪谱生物科技有限公司；超声波清洗仪，昆山市超声仪器有限公司；恒温水浴锅，巩义市予华仪器有限责任公司。

橘红的处理方法参照《中华人民共和国药典》^[1]和孙振刚等^[12]的研究，将新鲜的大红袍剥皮，放置1、3、5、7、9、11、13 d，用美工刀将橘白刮离，留透亮的外表皮，切条，60 ℃烘干。取部分烘干样品打粉后过4号药典筛，于阴凉干燥处备用。

精密称取样品粉末0.5 g，加入45 mL去离子水中，回流提取2 h，冷却后转移并定容至50 mL，精密量取1 mL提取液于50 mL离心管中，加入乙醇5 mL，震摇2 min，4 ℃醇沉2 h，取出，11 000 r/min离心处理15 min，弃去上清液，加去离子水溶解沉淀，转移至10 mL容量瓶中，加去离子水定容至刻度，摇匀，即得。

通过紫外—可见分光光度法测定橘红样品的总多糖含量，参照Yue等^[13]和Xu等^[14]测定陈皮总多糖含量的方法(对苯酚—硫酸法)略有改动。取样品0.5 mL，加入0.5 mL 5%苯酚溶液，加入1 mL去离子水，迅速加入3 mL浓H₂SO₄，在沸水浴条件下反应20 min，取出冷却至室温，以无水葡萄糖为对照，去离子水为溶剂空白，于490 nm波长处测定吸光度值，每个样品平行测定3次。

取橘红粉末0.5 g，加入25 mL 60%乙醇溶液，称质量，超声处理(功率400 W，频率40 kHz)45 min，待自然冷却至室温后，用60%乙醇补足失质量，充分振摇混合。取适量提取液12 000 r/min离心10 min，精密吸取2 mL上清液定容至10 mL，即得待测溶液。

通过紫外—可见分光光度法测定橘红总黄酮含量，AlCl₃比色法参照邓海丹等^[15]的方法略有改动。移取待测液0.5 mL于10 mL比色管中，先加入0.5 mL 5% NaNO₂溶液，振摇均匀后静置6 min，再加入0.5 mL 10%Al(NO₃)₃溶液，振摇均匀后静置6 min，最后加入4.0 mL 4% NaOH溶液，充分混匀后于暗处静置15 min进行显色反应。在505 nm波长处测定吸光度值，以60%乙醇为空白，芦丁为对照品测定并计算其含量，每个样品平行测定3次。

通过紫外—可见分光光度法测定橘红总多酚含量，福林酚比色法参照盛钊君等^[16]的方法略有改动。移取待测样品溶液1 mL到10 mL比色管中，依次加入0.5 mL福林酚试液，充分混匀后反应6 min，再加入7.5%碳酸钠溶液1.5 mL，纯水定容至10 mL，50 ℃水浴避光反应60 min。在760 nm波长处测定吸光度值，以60%乙醇为空白，没食子酸为对照计算其含量，每个样品平行测定3次。

16种氨基酸含量测定参照胡前梅等^[17]的方法，称取0.2 g橘红粉末置于25 mL水解管中，随后加入10 mL 6.0 mol/L的盐酸溶液，摇匀，称定质量，抽真空，封口。将水解管放入恒温干燥箱中，在110 ℃下水解24 h，冷却，称定质量，以6 mol/mL盐酸补足失质量，摇匀，12 000 r/min离心10 min，精密量取上清液0.4 mL挥干，用0.02 mol/L盐酸溶解并定容至10 mL，用0.22 μm无机滤膜过滤，取滤液上机测定。

橙皮苷、川陈皮素和橘皮素含量通过高效液相色谱法进行测定，参照《中华人民共和国药典》^[1]陈皮含量测定项通则0512。

称取0.5 g橘红样品于具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇溶液50 mL，盖上塞子后超声提取1 h，0.22 μm滤膜(有机系)滤过后分装于进样小瓶中，即得。

Waters 2998 PDA Deleclor型半自动高效液相色谱仪，色谱柱：月旭AQ-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，A相：甲醇；B相：0.1%磷酸；流速：1mL/min；柱温：30 ℃；梯度洗脱程序：0~2 min，18%A；2~8 min，18%~23%A；8~40 min，23%~60%A；40~45 min，60%~65%A；45~55 min，65%~70%A；55~60 min，70%~73%A；60~65 min，73%~85%A；65~66 min，85%~15%A；进样量：10 μL；检测波长：300 nm。

取1.3.3.1项下样品溶液，按照文献[18]的方法加入适量DPPH·工作液和ABTS+·工作液，避光反应30 min，于对应波长下测定吸光度。以无水60%乙醇为空白，维生素E为阳性对照，每个样品平行测定3次，根据公式计算样品自由基清除率(R)。

式中：A₀为乙醇溶液总吸光度；A_i为样品溶液吸光度；A_j为DPPH·或ABTS+·与提取溶剂混合后的吸光度。

对于单因素方差分析，使用SPSS 20进行统计，Origin 2021绘图，多元统计学分析采用 https://www.biodeep.cn/home完成，p＜0.05为差异有统计学意义。

图 1显示，随着放置时间的延长，橘红的外观特征并无明显区别，但其油室的透光率明显增加，白光透射后油室更加明亮。这可能是在放置过程中，由于橘皮堆叠的腐烂过程导致，橘皮中橘白相较于橘红，挥发油含量少，更容易通过空气中的孢子产生霉变^[19-20]。由于腐烂首先出现在橘白部分，因此在使用美工刀刮离橘白时，更容易将其刮离彻底，因此放置越久，其油室透光度越高。

多糖类成分具有广泛的生物活性，其作用机制涉及增强机体免疫应答、抗肿瘤、调节血脂代谢、清除自由基及调节肠道菌群等^[21]。不同刮皮时间橘红样品中总多糖含量结果见图 2，随着放置时间的增加，橘红总多糖含量呈现出先降低后升高最后再降低的趋势。

由图 2可知，各种处理后橘红样品中的总黄酮和总多酚含量的变化趋势基本一致，均为先上升后下降再持平。橘红样品的总黄酮和总多酚含量分别在6.90%~7.47%和1.05%~1.16%，其中第5 d样品中总黄酮和总多酚含量最高，分别为7.47%和1.16%；第1 d样品中两者含量均最低，分别为6.90%和1.05%。

氨基酸的分类按照文献[22]的分类方法进行整理，分为必需氨基酸、非必需氨基酸或赋有不同风味的氨基酸。共分离出20个氨基酸色谱峰，标定出16个氨基酸，并对其进行了定量分析，含量测定结果见表 1。橘红样品中总氨基酸质量分数为22.99~29.59 mg/g，最高为第11 d的样品，其次是第3 d，而含量最低的是第9 d的样品。各组样品中必需氨基酸共有7种，其含量趋势大致相同，由高到低依次为赖氨酸＞异亮氨酸＞缬氨酸＞苏氨酸＞精氨酸＞苯丙氨酸＞亮氨酸，其中赖氨酸含量最高；非必需氨基酸共9种，依次为脯氨酸＞谷氨酸＞天冬氨酸＞络氨酸＞丝氨酸＞甘氨酸＞丙氨酸＞组氨酸＞半胱氨酸，其中脯氨酸含量最高。

人体必需氨基酸是合成蛋白质的主要来源，根据FAO/WHO氨基酸理想模式标准，必需氨基酸(EAA)/非必需氨基酸(NEAA)大于0.6为较好蛋白^[23]。EAA在NEAA和总氨基酸(TAA)中的占比随着放置时间的增加，其比值逐渐下降，而后略有回升(图 3a)，结合表 1中EAA含量的变化，发现第1 d、第11 d和第13 d样品EAA/NEAA占比较高，EAA/NEAA＞50%，EAA/TAA＞30%，与FAO/WHO氨基酸理想模式标准较为接近^[24]，提示橘红作为药食两用中药其营养基础具有科学性。

果皮作为果实的外层保护组织，不仅是抵御外界环境胁迫的屏障，更是多种营养成分的富集部位^[25]。橘皮中的氨基酸含量比果肉含量高，赋予陈皮或者橘红特殊的风味和颜色^[26-27]。丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸和脯氨酸等为甜味氨基酸，赋予橘红甜味；谷氨酸、天冬氨酸和缬氨酸则赋予鲜味和酸味；亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、组氨酸和精氨酸则与苦味相关。结果表明，第3 d样品中表现出更多的甜味，第11 d样品除在甜味和其他风味上占比更高外，在苦味上也具有较高的占比(图 3b)。因此，从营养成分含量角度来说，放置11 d后刮皮的橘红样品中各类氨基酸含量均较高，但其风味也会偏苦。

各样品液相含量测定结果见图 4，其中橙皮苷的质量分数为3.98%~6.68%，随着放置时间延长呈先升高后降低，其中第5 d最高，为6.68%；川陈皮素和橘皮素含量变化幅度较小，其中川陈皮素质量分数为0.75%~0.89%，橘皮素质量分数为0.25%~0.36%；两种成分含量变化趋势为先增加后降低，在第7 d和第9 d时最高，差异无统计学意义(p＜0.05)。

取橘红样品按1.3.6.1项下方法制备供试液，1.3.6.2项下色谱条件连续进样6次，以峰形对称，分离度和响应强度高的19号峰为参照，计算出共有峰保留时间的相对标准偏差RSD＜0.05%，峰面积的RSD＜1.25%，表明仪器精密度良好。取橘红样品按1.3.6.1项下方法平行制备6份供试液，分别测定。以19号峰为参照，计算出共有峰保留时间的RSD＜0.06%，峰面积的RSD＜0.8%，表明该方法重复性良好。取橘红样品按1.3.6.1项下方法制备供试液，分别于0、2、4、8、12、24 h依照1.3.6.2色谱条件上机测定。以19号峰为参照，计算出共有峰保留时间的RSD＜0.18%，峰面积的RSD＜2.65%，表明该样品在24 h内稳定。

由图 5a可知，有26个橘红指纹图共有峰，对其中8个色谱峰进行了指认，分别是维采宁-2(14)，圣草次苷(16)，橙皮苷(19)，异橙黄酮(21)，甜橙黄酮(22)，6-去甲氧基橘皮素(23)，川陈皮素(25)，橘皮素(26)。图 5b显示，各橘红样品指纹图谱及共有模式图谱中，7批不同处理橘红样品的相似度为0.98~0.99，说明各样品之间共有峰差异较小。

ABTS和DPPH自由基清除率是评价样本体外抗氧化活性的指标之一^[28]。不同刮皮时间橘红样品的抗氧化活性结果如图 6，ABTS和DPPH自由基清除率以维生素E当量换算后为39.35~42.32 mg/g和47.38~58.66 mg/g。ABTS和DPPH总体变化趋势较为一致，均呈现出先升高后降低的趋势，ABTS自由基清除率在第11 d出现拐点，而DPPH在第5 d时出现转折。第5 d样品的DPPH抗氧化活性最高，第1 d最低，这可能与橘红样品中总黄酮、多酚和其他成分含量的改变有关。

采用皮尔逊相关性分析法，评估了样品中总多糖、总黄酮、总多酚、7类氨基酸以及橙皮苷、川陈皮素和橘皮素的含量与ABTS和DPPH抗氧化活性之间的相关性。由图 7可知，总多糖含量与总黄酮(p＜0.01)和总多酚(p＜0.05)呈显著负相关；总黄酮、总多酚和橙皮苷与DPPH抗氧化活性呈极显著正相关(p＜0.01)，总多糖与ABTS抗氧化活性呈显著负相关(p＜0.05)；川陈皮素与橘皮素呈极显著正相关(p＜0.01)，与苦味氨基酸、鲜味和酸味氨基酸呈显著负相关(p＜0.05)；苦味氨基酸含量与总黄酮、总多酚、橙皮苷以及橘皮素含量呈显著负相关(p＜0.05)；总氨基酸与各类风味氨基酸均呈极显著正相关(p＜0.01)。

为了综合评价不同刮皮时间对橘红质量的影响，本研究通过样品总成分(多糖、多酚和黄酮)含量、各种氨基酸含量、化学成分(橙皮苷、川陈皮素和橘皮素)含量和抗氧化活性为指标进行了主成分分析，由图 8a可知，PC1和PC2的贡献率总和为72.7%，说明模型拟合良好。第11 d样品与其他样品间距离较远，说明其质量差异较其余组别大。质量相似组通常较为接近，如第3 d和第5 d、第7 d和第9 d、第1 d和第13 d。此外，为了进一步分析差异化合物，我们进行了OPLS-DA筛选，由表 2可知，共有11个VIP＞1的化合物，分别是橙皮苷、无味氨基酸、组氨酸、络氨酸、脯氨酸等。

以不同刮皮时间橘红样品的总成分(多糖、黄酮和多酚)、化学成分(橙皮苷、川陈皮素和橘皮素)、各类氨基酸含量和抗氧化活性为指标对各样品进行聚类分析，结果见图 8b，红色表示相对含量较高，蓝色表示相对含量较低。其中第11 d单独聚为一类，第1 d和第13 d橘红样品被聚为一类，第3 d和第5 d、第7 d和第9 d橘红样品分别聚为一类，这个聚类结果与PCA分析结果一致。二级聚类结果显示，各种样品被分为两类，说明各样品间质量存在差异，而第11 d橘红样品中各成分的相对含量均较高，因此被单独聚为一类。

以不同刮皮时间橘红样品的总成分(多糖、黄酮和多酚)、化学成分(橙皮苷、川陈皮素和橘皮素)、各类氨基酸含量和抗氧化活性为变量，进行权重分析。以促进其质量的指标作为正向指标，参照文献[29]对各成分权重进行计算，结果见表 3。川陈皮素和无味氨基酸的权重系数较其余指标大，说明二者对权重评分的影响较大。熵权法得分和排序结果见表 4，根据各指标的综合评价，第11 d样品的得分最高，其次是第5 d，第1 d得分最低。熵权法分析结果显示，橘皮于放置11 d后刮皮，加工处理为橘红时，该样品的综合质量最佳，其次是放置后第5 d刮皮的橘红样品。

古红橘作为三峡地区的主要水果产物，在重庆万州、云阳等地广泛种植，经济效益良好，而橘红作为柑橘产业的后端支持之一，对产业链的延长、市场竞争力及柑橘产品市场需求的提升具有积极的促进作用^[9]。目前，橘红的加工仍以传统手工作业为主，尚未实现规模化生产，这种加工模式导致原料常需经历较长的储存周期，对柑橘皮品质造成一定影响^[10]。现阶段关于橘红的研究主要集中在化学成分和药理活性等方面，针对其加工方面的研究较少。本研究以放置时间为因素，探究不同放置时间后刮离橘白对橘红品质(包括营养成分、化学成分和抗氧化活性)的影响，为橘红产业化生产提供理论支撑和基础。

研究中发现，尽管各样品橘红的油室在放置期间均保持饱满，但其透光度随时间延长而显著增加，这可能是由于微生物优先侵染并降解了质地疏松的橘白(中果皮)，导致其结构破坏、透光性增强；而富含挥发油的外表皮则因具有抗菌性，结构保持相对稳定，不易腐烂^[19-20]。本研究还对不同放置时间加工的橘红样品中的营养成分(总多糖、总黄酮、总多酚以及氨基酸)进行了定量分析。总多糖含量随着放置时间呈先降低后升高最后再降低的趋势，推测在放置早期(第1~9 d)，橘皮中的微生物菌落如初级降解菌拟杆菌属、假单胞菌和次级降解菌如乳酸杆菌、双歧杆菌会分泌果胶酶、纤维素酶等物质，将橘红中的多糖分解为各种形式的单糖^[30]；放置中期(第11 d)，各种菌属分泌的分解酶活性降低，被分解成各种单糖的多糖作为碳源促进了其他合成多糖的菌属生长，如蓝藻等^[31]，导致中期总多糖含量的上升。橘红样品的总黄酮和总多酚含量分别在6.90%~7.47%和1.05%~1.16%，略高于刘瑞婷^[32]对陈皮的研究，这可能与去除橘白部分存在较大关系。相比成雯^[33]测定市面上橘红中的总黄酮含量，本研究制备的样品含量较低，这可能是化橘红与古红橘橘红基原上的差异所致。随着放置时间的增加，必需氨基酸与总氨基酸和非必需氨基酸含量占比呈先降低后增高的趋势，这可能是细胞代谢、酶促反应以及蛋白质水解等多种途径共同作用的结果。放置前期(第1~9 d)，采摘后的橘皮依然进行呼吸作用，为细胞代谢提供能量，天冬氨酸、谷氨酸等氨基酸作为碳源参与三羧酸循环，被转化成α-酮戊二酸^[34]。放置后期(第11~13 d)，随着橘皮中细胞失水，其结构破坏后释放液泡中的蛋白酶(半胱氨酸水解酶)，催化蛋白质降解为氨基酸；同时微生物(如酵母菌和乳酸菌等)大量繁殖导致橘皮的降解也会分泌蛋白酶对底物进行水解^[35]。因此，随着放置时间的增加，其氨基酸含量呈先降低后增加的趋势。

橙皮苷、川陈皮素和橘皮素作为橘红成分中的活性特征成分，具有抗炎、抗肿瘤以及抗氧化等药理作用^[36]。在各橘红样品中橙皮苷的含量随放置时间先上升后下降，相比川陈皮素和橘皮素受影响的程度更大。橙皮苷属于二氢黄酮醇苷类化合物，由橙皮素和芸香糖通过β-糖苷键连接而成，而川陈皮素和橘皮素属于多甲氧基黄酮类化合物，相比之下带有糖苷键的橙皮苷更容易受到外界环境的影响从而导致橙皮苷的降解。橘皮表面微生物具有次生代谢物的合成和分解功能，这也是橘皮物质基础累积的主要原因^[37-38]。黑曲霉菌作为橘皮物质基础累积的重要优势菌群，其代谢产生的α-L-鼠李糖苷酶与β-D-葡萄糖苷酶对橙皮苷底物转化率高达90%^[39]，因此，我们推测存在环境微生物对橘红中橙皮苷进行转化与合成，导致其含量变化较川陈皮素和橘皮素变化幅度更大。

橘红样品的体外抗氧化活性(ABTS及DPPH法)评价结果显示，其自由基清除能力变化趋势高度一致。相关性分析表明，样品中DPPH抗氧化活性主要与总黄酮、总多酚和橙皮苷的含量呈极显著正相关(p＜0.01)，其原因有以下两点：1) 总黄酮和总多酚类成分结构主要由多羟基化合物构成，多羟基化合物中酚羟基具有较强的还原性，因此赋予其强大的自由基清除能力^[40-41]；2) 以橙皮苷为代表的黄酮苷类单体，其含量变化也与抗氧化活性趋势高度同步，证实了黄酮苷类物质在抗氧化过程中的重要贡献，这与文献[42]报道的一致。

本研究评价了不同刮皮时间对橘红营养成分、化学成分以及抗氧化活性的影响。结果表明，橘皮自果肉分离后放置不同时间再进行刮皮处理，所获得的橘红样品各项指标间存在明显差异。放置不同时间刮皮橘红样品外观特征并无明显差异，随着放置时间增加，在体视显微镜下观察到其油室变得透亮。第11 d样品中总多糖和总氨基酸含量最高，总多酚、总黄酮、川陈皮素和橘皮素含量次之，DPPH抗氧化活性较低；相比之下，第5 d样品中含有最高的总多酚、总黄酮，DPPH抗氧化活性最高，但其总氨基酸含量较低。根据皮尔逊相关性分析，发现橘红样品中总多糖与总黄酮(p＜0.01)和总多酚(p＜0.05)呈显著负相关，总黄酮与总多酚和橙皮苷呈极显著正相关(p＜0.01)；橘红样品中橙皮苷、总黄酮和总多酚含量与DPPH抗氧化活性呈极显著正相关(p＜0.01)，表明橙皮苷等多甲氧基化合物在抗氧化方面有重要作用；川陈皮素与橘皮素呈极显著正相关(p＜0.01)，与苦味氨基酸、鲜味和酸味氨基酸呈显著负相关(p＜0.05)；总氨基酸含量与甜味、苦味、无味、鲜味和酸味氨基酸呈极显著正相关(p＜0.01)。此外，根据PCA和聚类热图分析，总多糖、总黄酮、总多酚、橙皮苷、川陈皮素、橘皮素、氨基酸含量、指纹图谱共有峰面积和抗氧化活性(DPPH和ABTS)可以很好地区分不同刮皮时间的橘红样品，OPLS-DA分析发现11个差异性成分(VIP＞1)，模型较稳定且具有一定的预测能力。根据权重分析，发现第11 d橘红样品得分最高，其次是第5 d，因此认为放置11 d后刮皮橘红样品的品质最佳。综上所述，本研究明确了橘皮不同放置时间后对刮皮橘红品质的影响，为其规范化加工工艺的制定和产业化生产提供了科学依据，并为橘红在中药饮片、健康食品原料及天然提取物等方向的应用奠定了基础。