为全面鉴定生姜ZoSnRK基因家族，首先从NCBI数据库获取拟南芥已报道的所有SnRK蛋白序列作为参考，利用这些序列对本地生姜基因组蛋白质数据库^[15]进行BLASTP同源比对(E-value＜10^-10)，初步筛选潜在家族成员。随后，通过Pfam数据库在线工具对所有候选蛋白序列进行保守结构域(SnRK，PF00069)验证。将鉴定获得的ZoSnRK蛋白序列与其拟南芥同源序列一并导入MEGA 11.0软件进行多序列比对。参数设置如下：空位开放罚分10，空位延伸罚分0.2，选用BLOSUM系列矩阵。采用最大似然法构建系统进化树，关键参数包括：自举重复1 000次，JTT+G氨基酸替代模型，缺失数据处理选用部分删除方式，位点覆盖度cutoff值设为50%，分支交换过滤器强度设置为中等。最终生成的系统发育树(NWK格式)利用Chiplot在线平台进行可视化与美化，采用环形布局图直观展示两物种SnRK蛋白间的进化关系。

对鉴定出的所有ZoSnRK蛋白，利用ExPASy在线平台ProtParam工具分析其基本理化性质，包括氨基酸数目、理论分子量、等电点(pI)、不稳定系数、脂肪族氨基酸指数和总平均亲水性(GRAVY)；使用SignalP 6.0预测蛋白序列中是否存在信号肽及其切割位点。通过Plant-mPLoc在线工具预测各蛋白的亚细胞定位；基于生姜基因组注释文件(GFF3格式)，提取各ZoSnRK基因的外显子-内含子结构信息，并利用GSDS 2.0在线工具进行可视化；采用MEME在线程序预测蛋白质的保守基序，最大基序数设定为10；进一步利用InterProScan数据库对所有识别出的基序进行功能注释，以明确其对应的已知结构域；最后，运用TBtools软件整合基因结构、保守基序及系统进化关系，生成综合示意图。

根据生姜基因组注释信息，确定各ZoSnRK基因在染色体上的物理位置，并利用TBtools软件的“Gene Location Visualize”功能进行可视化；采用该软件的MCScanX插件分析基因组中的共线性关系，并识别串联重复事件。为探究ZoSnRK基因家族的进化历史，使用DIAMOND软件对生姜全基因组蛋白序列进行自身比对，参数设置为：E值阈值为1e-5，最小序列一致性为40%。根据系统进化关系及染色体位置，对鉴定出的基因进行统一命名，格式为ZoSnRK1.1-ZoSnRK1.4、ZoSnRK2.1-ZoSnRK2.14及ZoCIPK01-ZoCIPK36。

利用TBtools软件提取各ZoSnRK基因转录起始位点(TSS)上游2 000 bp的启动子序列，以fasta格式提交至PlantTFDB v5.0数据库进行在线预测，分析可能存在的转录因子结合位点及其他顺式作用元件，通过Cytoscape软件对预测结果进行网络可视化，分析关键调控元件与基因之间的潜在关联。

利用PlantTFDB v5.0数据库中已验证的转录因子结合位点信息，对各ZoSnRK基因启动子区(转录起始位点上游2 000 bp)进行扫描。随后，将预测获得的潜在转录因子提交至PlantRegMap在线平台，基于拟南芥中已知的调控关系进行同源映射与网络预测，筛选出可能靶向ZoSnRK基因的高置信度转录因子。最后，使用Cytoscape软件构建并可视化由上游转录因子与其潜在靶基因(ZoSnRK)所组成的调控网络图。

为预测ZoSnRK蛋白的潜在互作伙伴及其参与的生物学通路，本研究基于STRING v12.0数据库进行蛋白互作网络分析。以鉴定出的ZoSnRK蛋白序列为查询对象，选择拟南芥为参考物种，筛选高置信度(综合评分≥0.7)的相互作用关系，结果以TSV格式导出。随后，使用Cytoscape 3.9.1软件对网络进行可视化呈现，并利用其内置工具分析网络的核心节点与拓扑属性。结合KEGG和GO富集分析结果，对ZoSnRK蛋白可能参与的生物学过程及分子功能进行预测。

从NCBI SRA数据库获取生姜转录组数据(登录号：SRP064226)，包含盐胁迫(NaCl 20 g/L)、干旱胁迫(15% PEG-6000)及水涝胁迫处理3天后的叶、根、根茎组织样本，各处理均包含3个生物学重复^[16]。为分析各ZoSnRK基因在胁迫条件下的表达水平，使用Cufflinks软件基于经比对和组装得到的转录本参考序列，计算每个基因在各样本中的FPKM值以标准化其表达量。将计算得到的FPKM值进行log₂(FPKM+1)转换，以降低数据偏态并增强后续可视化分析的区分度。利用TBtools软件绘制基因表达热图，分析ZoSnRK家族成员在不同胁迫处理下各组织中的表达模式。最后，通过DESeq2进行差异表达基因分析(筛选条件：|log₂FoldChange|≥1且FDR＜0.05)，并通过VENNY 2.1绘制韦恩图展示不同胁迫间差异表达基因的重叠与特有情况。

以“竹根姜”为材料，选取大小一致的姜种，经晒种消毒后在26 ℃黑暗条件下催芽至芽长约1.5 cm。每盆播种1块姜种，待植株长至约50 cm高时，选用长势一致、健康的姜苗进行胁迫处理。设置如下处理：①对照(正常水分管理)；②盐胁迫(每株使用20 g/L的NaCl溶液400 mL，连续灌根3 d)；③水涝胁迫(保持水面高于基质表面3 cm)。每处理5株幼苗，设3次生物学重复，分别于胁迫处理3 d后采集叶片(第3~4片完全展开叶)、根系(新生侧根)和姜块(根茎膨大部位)样品，用液氮速冻后于-80 ℃保存备用。使用RNA提取试剂盒(Vazyme)提取各组织总RNA，并反转录为cDNA。根据转录组数据分析选取ZoSnRK2.4、ZoSnRK2.5、ZoSnRK2.9、ZoSnRK2.10、ZoSnRK2.13、ZoCIPK14、ZoCIPK27、ZoCIPK30和ZoCIPK36基因进行验证，通过Primer Premier 5设计基因特异性引物(表 1)，以RBP为内参^[17]进行RT-qPCR，采用2^-ΔΔCt法^[16]计算基因相对表达量，并使用Duncan’s检验分析差异显著性(p＜0.05)。

本研究通过对生姜全基因组数据系统分析，共鉴定出54个具有完整SnRK保守结构域的基因，基于最大似然法构建的系统进化树分析表明，这些成员可明确划分为SnRK1、SnRK2和CIPK(SnRK3)3个亚家族，分别包含4个、14个和36个成员(图 1)。

对54个ZoSnRK家族成员的理化性质分析表明(表 2)，其氨基酸长度介于217 aa(ZoSnRK2.4)至901 aa(ZoSnRK1.2)之间，平均长度为433.15 aa；预测分子量范围为24.82 kDa(ZoSnRK2.4)至102.79 kDa(ZoSnRK1.2)。理论等电点(pI)分布在4.67(ZoSnRK2.12)到9.56(ZoCIPK35)之间，其中20个成员pI＜7，呈酸性，34个成员pI＞7，呈碱性。不稳定系数介于22.84(ZoCIPK05)至56.45(ZoSnRK2.1)之间，共有27个蛋白不稳定系数低于40，属于稳定蛋白，其余27个高于40，为不稳定蛋白。脂肪族氨基酸指数在73.49(ZoSnRK2.10)到105.00(ZoCIPK16)之间，总平均疏水性(GRAVY)值介于-0.66(ZoSnRK2.11)至-0.015(ZoCIPK16)之间，表明所有成员均为亲水性蛋白。亚细胞定位预测显示，多数ZoSnRK蛋白定位于细胞核(21个)，少数分布于细胞骨架与内质网等部位。

蛋白结构分析表明，ZoSnRK家族成员在结构上存在显著分化(图 2)。在ZoCIPK亚家族的36个蛋白中，有20个不含内含子；而在ZoSnRK1/2亚家族中，除少数几个没有内含子外，其他成员均含有1~5个内含子；此外，共有24个蛋白在其序列中预测到UTR区(图 2a)。保守结构域分析显示，SnRK1亚家族成员均包含典型的UBA_SnRK1_plant结构域；SnRK2亚家族成员主要包含STKc_SnRK2和PKc_like超家族结构域；而CIPK亚家族成员则普遍含有PKc_like超家族、STKc_SnRK3以及CIPK_C结构域(图 2b)。在ZoSnRK蛋白序列中共鉴定出10个保守基序(Motif1~Motif10)。其中，SnRK2亚家族中的ZoSnRK2.1和ZoSnRK2.4所含基序最少(仅2个)，而绝大多数ZoCIPK蛋白含有全部10个基序(ZoCIPK32缺少Motif7)，这些基序共同组成高度保守的结构域(图 2c)。

染色体定位结果显示，54个ZoSnRK基因在生姜11条染色体上呈不均匀分布(图 3)。其中，10号染色体分布最为密集，含有9个基因；其次是第18号和20号染色体，均含有8个基因；4号染色体仅含有1个基因(ZoCIPK4)。从亚家族分布来看，16号、18号和22号染色体同时分布有SnRK1、SnRK2和CIPK 3个亚家族成员，而2号、4号、6号、12号和20号染色体上则仅有CIPK亚家族成员。

为揭示ZoSnRK基因家族的进化特征，对该基因家族成员进行种内基因组分析(图 4)，包括染色体位置、全基因组基因密度分布、各基因的GC含量比值(GCratio，红色)及N含量比值(Nratio，蓝色)。共线性分析鉴定出19对由片段重复事件产生的重复基因对，存在于各亚族基因之间，这些重复可能通过基因剂量效应促进了家族成员的功能分化。

为进一步阐明ZoSnRK基因家族的进化起源，选取拟南芥(双子叶)、水稻(单子叶)、小果野蕉(单子叶)及番茄(双子叶)进行种间共线性比较。结果表明(图 5)，生姜与单子叶植物(水稻11对、小果野蕉62对)的共线基因数量显著多于双子叶植物(拟南芥1对、番茄3对)。这从基因组层面支持了生姜作为单子叶植物的分类地位，其SnRK基因家族与单子叶近缘物种具有更近的进化关系。生姜与小果野蕉之间存在大量共线基因(62对)，远多于其他比较物种，这可能与二者同属姜目(Zingiberales)有关，反映了较近的系统发育距离。

54个ZoSnRK基因启动子序列中共包含55种不同类型的顺式作用元件(图 6a)，包括光响应元件(19种，34.6%)、植物激素响应元件(13种，23.6%)、生长发育相关元件(13种，23.6%)与非生物胁迫响应元件(10种，18.2%)。其中，G-box、ABRE及Box 4等核心调控元件在家族成员中出现频率最高(图 6b)。Box 4与G-box为典型的光响应元件，提示ZoSnRK可能参与光信号调控的生理过程。此外，ABRE作为ABA响应元件广泛分布于ZoSnRK启动子区，进一步证明了该家族在ABA介导的胁迫信号通路中具有重要作用。

通过预测分析ZoSnRK基因启动子区的转录因子结合位点，发现共有36个转录因子(TF)家族可能参与其表达调控(图 7)。其中，C2H2、AP2/ERF、HD-ZIP、MADS-box、MYB及Dof等6类转录因子的预测结合频率较高，且结合度中心性值均为54，表明这些转录因子可能在ZoSnRK基因的转录调控中发挥关键作用。

通过STRING对蛋白互作网络进行预测，结果显示ZoCIPK18的互作连接度显著高于其他成员(图 8)，表明该蛋白作为核心枢纽蛋白具有协调上下游信号传递的关键作用。GO功能富集分析进一步发现，ZoSnRK蛋白显著富集于蛋白质磷酸化(GO：0006468)、信号转导(GO：0007165)及蛋白质修饰过程(GO：0035556)等生物学过程，说明ZoSnRK家族主要通过磷酸化修饰参与胁迫信号转导，从而调控植物的防御响应与代谢平衡。

转录组数据分析表明(图 9a)，ZoSnRK基因家族成员在非生物胁迫下呈现显著的组织特异性与功能分化表达模式。经盐胁迫处理后的叶片、根和根茎中分别有21个、12个和4个基因显著差异表达。其中，叶片中12个基因上调、9个下调；根中5个上调、7个下调；根茎中3个上调、1个下调。值得注意的是，ZoSnRK2.5和ZoCIPK14在3个组织中均被显著诱导表达(图 9b)，表明其在盐胁迫响应中可能具有核心调控作用。在干旱(PEG)胁迫下大部分基因无明显表达差异，仅在叶片中检测到ZoCIPK33轻微上调，根茎中ZoCIPK02与ZoCIPK31表达上调。ZoSnRK家族基因对水涝胁迫的响应主要集中在根和根茎组织，有27个基因在根中差异表达(13个上调、14个下调)，11个基因在根茎中差异表达(6个上调、5个下调)。其中，共有8个CIPK亚家族基因(ZoCIPK11、ZoCIPK13、ZoCIPK21、ZoCIPK22、ZoCIPK27、ZoCIPK29、ZoCIPK33、ZoCIPK36)在根与根茎中均显著差异表达；此外，ZoCIPK19、ZoCIPK20、ZoCIPK30、ZoCIPK31特异性地在根中诱导表达(图 9c)。

为验证转录组数据的可靠性，选取了在盐胁迫和水涝胁迫下响应显著的9个ZoSnRK基因(ZoSnRK2.4、ZoSnRK2.5、ZoSnRK2.9、ZoSnRK2.10、ZoSnRK2.13、ZoCIPK14、ZoCIPK27、ZoCIPK30和ZoCIPK36)，通过RT-qPCR分析其在不同组织中的表达模式。结果显示，RT-qPCR测定的基因表达趋势与转录组测序结果高度一致。在盐胁迫下，ZoSnRK2.4、ZoSnRK2.5和ZoCIPK14在根、叶及根茎中均被显著诱导表达。在水涝胁迫下，基因表达呈现显著的组织特异性：在根中，ZoSnRK2.4、ZoSnRK2.5、ZoSnRK2.10、ZoSnRK2.13、ZoCIPK27和ZoCIPK30显著上调表达(1.33~6.24倍)，而ZoCIPK14和ZoCIPK36的表达则受到显著抑制；在根茎中，ZoSnRK2.4、ZoSnRK2.5、ZoSnRK2.9、ZoCIPK27和ZoCIPK36被显著诱导，其余基因表达无显著变化(图 10)。

组织表达分析显示，ZoSnRK2.5和ZoCIPK14在多个组织中均显著上调表达，而这两个基因与拟南芥中同源基因相似度分别达到86.2%和60.3%，利用STRING数据库预测蛋白互作网络(图 11)，结果表明，ZoSnRK2.5与AHG1、ABF2、PP2CA等蛋白相互作用，共同参与缺水响应、脱落酸响应等重要生物学过程(图 11a、11b)；ZoCIPK14则与CBL1/2/3/4/9/10等蛋白相互作用，共同参与盐胁迫响应及钙调信号转导过程(图 11c、11d)。由此推测，这两个基因很可能是调控生姜盐胁迫应答的关键枢纽基因。

SnRK家族是植物感知并整合环境胁迫信号的核心组件，在调控能量平衡、激素信号转导及逆境应答网络中发挥着至关重要的作用^[18]。尽管该家族在拟南芥、水稻等模式植物中的功能特征已较为明晰，但在生姜这类基因组复杂并采用无性繁殖方式的作物中，其完整的家族图谱与功能特性仍属空白。本研究从生姜基因组中共鉴定出54个ZoSnRK基因，并将其系统划分为SnRK1、SnRK2和CIPK 3个亚家族。通过生物信息学分析以及其在非生物胁迫下的表达模式进行多层次解析，既深化了对单子叶植物姜目物种SnRK基因家族的认知，又为生姜抵抗盐渍和水涝胁迫的分子机理提供了重要的候选基因资源和理论依据。

片段复制事件是驱动生姜ZoSnRK基因家族规模扩张的关键进化动力^[19]。在本研究中，通过共线性分析鉴定出19对由片段复制产生的基因对，且广泛分布于不同的系统进化分支中，说明复制后的基因赋予了该家族更强大的遗传可塑性，从而增强生姜适应多样化环境挑战的潜力。另外，生姜与同属姜目的小果野蕉之间存在高达62对共线基因，远超过其与水稻、玉米等其他单子叶植物的共线基因对数，更显著多于拟南芥、番茄等双子叶植物，说明在单子叶植物生姜中，其SnRK基因家族与姜目近缘物种存在高度保守的进化关系，姜目作物SnRK基因的相关功能研究成果在近缘物种间具有较高的参考与借鉴价值。

对ZoSnRK家族成员的系统进化与蛋白质结构域分析发现，SnRK1亚家族(仅含4个成员)作为高度保守的“细胞能量感应器”均包含典型的UBA_SnRK1_plant结构域^[20]。该结构域对于感知细胞内AMP/ATP比值等能量状态至关重要，推测该亚家族在协调生姜整体能量代谢稳态与胁迫适应过程中发挥核心调控作用^[21]。SnRK2亚家族是ABA信号通路的核心正调控激酶，成员主要含有STKc_SnRK2等特征结构域^[22]。该亚族成员在非生物胁迫下被ABA激活，进而通过磷酸化下游转录因子或膜通道蛋白，介导气孔运动以及渗透保护物质合成等一系列防御反应^[23]。CIPK亚家族(含36个成员)结构最为复杂，其蛋白普遍含有负责感知钙信号的CIPK_C结构域^[24]，通常与特定的CBL蛋白形成复合体，激活由各种胁迫(如盐、涝、低钾)触发的钙离子信号，并将其转化为对离子转运系统和活性氧平衡机制的精密调控^[25-26]。因此，CIPK亚家族很可能是生姜应对离子毒害等胁迫、维持细胞离子动态平衡的关键执行者。

对ZoSnRK基因上游启动子区域的顺式作用元件分析，为解析其胁迫响应特性提供了直接的DNA序列证据^[27]。分析发现，启动子区大量富集了脱落酸响应元件(ABRE)、光响应元件(如G-box，Box 4)以及其他多种与非生物胁迫相关的调控元件。其中，ABRE元件的广泛分布，与SnRK2亚家族作为ABA信号核心组件的功能定位高度吻合，从基因组水平证实了ZoSnRK家族深度参与ABA介导的胁迫信号网络^[28]。转录组测序与RT-qPCR试验数据，从基因表达水平上有力验证了上述生物信息学预测，并进一步揭示了ZoSnRK基因响应胁迫的组织特异性与胁迫类型特异性。在盐胁迫下，根、叶、根茎中均有大量基因表现出显著性差异表达。值得注意的是，ZoSnRK2.5和ZoCIPK14在多个组织中均显著上调表达，这两个基因与拟南芥中同源基因相似度分别达到86.2%和60.3%；通过STRING预测，ZoSnRK2.5与AHG1、ABF2、PP2CA等蛋白存在相互作用，共同参与缺水响应、脱落酸响应等重要生物学过程；而ZoCIPK14可与CBL1/2/3/4/9/10等蛋白相互作用共同参与盐胁迫响应及钙调信号，进一步说明它们极有可能是调控生姜盐胁迫应答的核心枢纽基因。在水涝胁迫下，差异表达基因主要集中在根和根茎中，且所有在根与根茎中共同响应的基因均属于CIPK亚家族。这一发现与CIPK蛋白解码钙信号、调控离子稳态的核心功能完美契合，说明CIPK亚家族可能是生姜根系应对涝害导致的缺氧环境与离子平衡紊乱的关键基因。相比之下，在模拟的干旱(PEG)胁迫下，ZoSnRK基因的表达无显著性差异，这可能反映了生姜自身对干旱较为敏感的特性。

综上，本研究通过生物信息学分析，系统揭示了生姜ZoSnRK基因家族的进化、结构特征、功能分化及其在非生物胁迫响应中的核心作用。该家族通过片段复制事件实现扩张，与姜目近缘物种(小果野蕉)进化关系紧密；3个亚家族(SnRK1、SnRK2、CIPK)在结构上明确分化，分别对应能量感知、ABA信号转导及钙信号-离子稳态调控功能，构成了一个协同响应的分子网络。表达分析证实SnRK2与CIPK亚家族在生姜响应盐胁迫与水涝胁迫中扮演关键角色，并表现出显著的组织特异性。后续研究可聚焦ZoSnRK2.5和ZoCIPK14等关键候选基因的功能验证，深入解析其如何通过调控ABA信号或与CBL蛋白互作等分子机制，从而为生姜抗逆分子育种提供直接靶点与理论支撑。