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2017 Volume 39 Issue 5
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Min DU, Bao-zhen NIU, Meng-ying JIA, et al. Gene Cloning and Polymorphism Analysis of Mitochondrial 12S rRNA and 16S rRNA of Bagarius yarrelli[J]. Journal of Southwest University Natural Science Edition, 2017, 39(5): 83-89. doi: 10.13718/j.cnki.xdzk.2017.05.013
Citation: Min DU, Bao-zhen NIU, Meng-ying JIA, et al. Gene Cloning and Polymorphism Analysis of Mitochondrial 12S rRNA and 16S rRNA of Bagarius yarrelli[J]. Journal of Southwest University Natural Science Edition, 2017, 39(5): 83-89. doi: 10.13718/j.cnki.xdzk.2017.05.013
shu

Gene Cloning and Polymorphism Analysis of Mitochondrial 12S rRNA and 16S rRNA of Bagarius yarrelli

  • 1.

    Key Laboratory for Quality, Efficient Cultivation and Security Control of Crops in Colleges and Universities of Yunnan Province, Honghe University, Mengzi Yunnan 661199, China

  • 2.

    College of Life Science and Technology, Honghe University, Mengzi Yunnan 661199, China

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  • Corresponding author: Yan-hong LIU ; 
  • Received Date: 18/09/2016
    Available Online: 20/05/2017

  • MSC: Q959.4

  • Twelve Bagarius yarrelli were collected from Hekou County in Yunnan Province, and their DNA was extracted with the phenol-chloroform method. Specific primers were designed according to the conservative region of 12S rRNA and 16S rRNA gene sequences of Sisoridae species deposited in GenBank, DNAMAN software was used to carry out sequence alignment analysis while MEGA 4.0 program was used to calculate the base content, genetic distance and phylogenic tree of the fish. The results were as follows. ① Twelve sequences of 12S rRNA 954 bp in length and 12 sequences of 16S rRNA 535 bp long were obtained. ② Sequence homology between 12S rRNA gene, 16S rRNA gene and the total 12S rRNA+16S rRNA of 12 samples were 99.89%, 99.95%, 99.89%, respectively. ③ The content of A base of the sequences of 12S rRNA, 16S rRNA, and 12S rRNA+16S rRNA of the 12 B. yarrelli was high. ④ The average genetic distance of the 12 B. yarrelli was 0.002 while their average ratio of conversion and transversion was 3.065. ⑤ The phylogenetic tree constructed with the Neighbor-Joining (NJ) method demonstrated that B. yarrelli forms a separate category and the approval rating reached 99%, which was similar to the traditional morphological classification.
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  • [1] 田树魁, 薛晨江, 冷云, 等.巨魾的生物学特性初步研究[J].水生态学杂志, 2009, 30(3): 115-117.

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通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com
  • 1. 

    沈阳化工大学材料科学与工程学院 沈阳 110142

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Gene Cloning and Polymorphism Analysis of Mitochondrial 12S rRNA and 16S rRNA of Bagarius yarrelli

    Corresponding author: Yan-hong LIU ; 
  • Received Date: 18/09/2016
  • Available Online: 20/05/2017

Abstract: Twelve Bagarius yarrelli were collected from Hekou County in Yunnan Province, and their DNA was extracted with the phenol-chloroform method. Specific primers were designed according to the conservative region of 12S rRNA and 16S rRNA gene sequences of Sisoridae species deposited in GenBank, DNAMAN software was used to carry out sequence alignment analysis while MEGA 4.0 program was used to calculate the base content, genetic distance and phylogenic tree of the fish. The results were as follows. ① Twelve sequences of 12S rRNA 954 bp in length and 12 sequences of 16S rRNA 535 bp long were obtained. ② Sequence homology between 12S rRNA gene, 16S rRNA gene and the total 12S rRNA+16S rRNA of 12 samples were 99.89%, 99.95%, 99.89%, respectively. ③ The content of A base of the sequences of 12S rRNA, 16S rRNA, and 12S rRNA+16S rRNA of the 12 B. yarrelli was high. ④ The average genetic distance of the 12 B. yarrelli was 0.002 while their average ratio of conversion and transversion was 3.065. ⑤ The phylogenetic tree constructed with the Neighbor-Joining (NJ) method demonstrated that B. yarrelli forms a separate category and the approval rating reached 99%, which was similar to the traditional morphological classification.

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  • 巨魾Bagarius yarrelli Sykes属于脊椎动物亚门Vertebrate，硬骨鱼纲Teleostei，鲇形目Siluriformes，鮡科Sisoridae，魾属Bagarius.因肌肉呈黄色，俗称“面瓜鱼”、“黄鱼”，在中国仅分布于云南省境内的澜沧江、怒江、元江水系，个体可超过50 kg[1].巨魾与其他鱼类相比，一般捕食小型水生动物[2-3].其肉质风味独特，深受云南版纳、普洱、河口和保山等地人民的喜爱.云南省渔业科学研究院成功地进行了人工繁殖[4].

    近年来，鱼类线粒体基因中的12S rRNA基因和16S rRNA基因被用来进行鱼类的遗传多样性分析等[5]对东方鲀属鱼类的Cytb和12S rRNA基因的序列变异情况进行了研究；程国宝等[6]对梭鱼和鲻鱼的16S rRNA和COI基因序列进行了比较分析；唐优良等[7]利用12S rRNA基因对8种笛鲷科鱼类的系统进化进行了分析；童馨等[8]对黄姑鱼的16S rRNA基因序列特征进行了分析，王茜等[9]利用16S rRNA基因研究了尖塘鳢属鱼类的系统进化关系.本文通过对12尾魾属巨魾的12S rRNA，16S rRNA进行测序，序列结果与GenBank里的近缘鱼类进行同源性比较，为阐明巨魾的遗传结构，并进一步开发利用提供理论依据.

1.   材料与方法

    1.1.   实验材料

  • 用于本实验研究的材料来源于云南省河口县采集的12条巨魾，从每条鱼身上剪取适量的肌肉组织放入EP管中，加入无水乙醇，做好标签后保存于-4 ℃冰箱中.

    • 1.2.   实验方法

  • 采用杜民等[10]的方法提取巨魾基因组DNA.利用琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统下用紫外光照射进行DNA检测，并拍照记录.

    • 1.3.   巨魾12S rRNA基因和16S rRNA基因引物设计

  • 从GenBank中已经发表的鮡科鱼类的线粒体序列，在保守区采用Primer Premier 5软件设计巨魾特异的12S rRNA和16S rRNA引物共计4对(表 1)[11].

    • 1.4.   巨魾12S rRNA基因和16S rRNA基因的PCR扩增及检测

  • 巨魾12S rRNA和16S rRNA基因的扩增在PCR扩增仪上进行.其反应体系见表 2.

    PCR反应条件为94 ℃预变性4 min，然后95 ℃变性30 s，退火温度依引物而定，72 ℃延伸90 s，共34个循环，最后72 ℃延伸6 min，4 ℃保存.利用1%的琼脂糖凝胶电泳在凝胶成像系统中照相并保存.

    • 1.5.   目的片段回收、连接、转化

  • 将检测具有目的片段的PCR扩增产物，用2%的琼脂糖凝胶电泳后在紫外分光光度仪中切下目的片段.用DNA回收试剂盒回收，纯化后克隆到大肠杆菌(具体操作步骤参照回收试剂盒里的说明书).

    • 1.6.   单克隆检测及测序

  • 挑取单克隆，在含氨苄青霉素的LB培养基中，37 ℃振荡培养过夜(14~16 h).利用M13通用引物M13(5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3')和RV-M(5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3')进行菌液PCR，筛选出阳性单克隆，送南京金丝瑞生物科技公司测序.

    • 1.7.   数据处理

  • 处理后得到的12条序列与GenBank里查到的澜沧江巨魾序列利用DNAMAN软件进行对比剪切，得到目的序列.再利用MEGA5.0[12]软件里的Kimura 2-Parameter方法分析12尾巨魾的12S rRNA基因和16S rRNA基因序列碱基含量、遗传距离；利用MEGA5.0软件里的Neighbor-Joining(NJ)法建立9属12种鮡科鱼类的分子系统进化树.

2.   结果与分析

    2.1.   DNA检测图片

  • 巨魾基因组DNA的提取采用传统的酚-氯仿方法，λDNA /Hind Ⅲ作为相对分子质量标准，提取的DNA片段在21 226 bp左右(图 1).

    • 2.2.   引物退火温度优化结果

  • 本研究中4对引物的碱基含量不同，退火温度不同.以Baya1F和Baya1R引物对为例，其梯度PCR的退火温度设为12个，依次为53 ℃，53.5 ℃，54.2 ℃，55.1 ℃，56.5 ℃，57.7 ℃，58.6 ℃，59.9 ℃，61.1 ℃，62.1 ℃，62.7 ℃，63 ℃，电泳检测结果见图 2.

    • 2.3.   巨魾PCR扩增结果

  • 5对巨魾特异性引物对12条巨魾的基因组DNA进行PCR扩增，Baya1F和Baya1R引物对扩增结果见图 3，12个体扩增的目的片段位于750 bp左右(图 3).

    • 2.4.   目地片段回收、克隆

  • 将巨魾12个体PCR扩增结果得到的目的片段利用胶回收试剂盒进行回收，然后连接到载体，转化到感受态细胞进行扩大培养，进行菌液PCR来筛选阳性克隆，Baya1F和Baya1R引物对扩增目的片段胶回收结果见图 4.

    • 2.5.   多样性分析结果

    2.5.1.   巨魾12S rRNA与16S rRNA基因序列碱基组成及单倍型

  • 扩增得到12条巨魾的12S rRNA基因片段经序列比对，长度为954 bp.得到6种单倍型，其中2号、3号、8号、9号个体具有相同的单倍型；样品6号、7号、10号、12号具有相同的单倍型.在6种12S rRNA的单倍型中，简约变异信息位点1个，约占全部位点的0.19%；变异位点有8个，约占全部位点的0.8%；保守位点946个，约占全部位点的99.1%；碱基T，C，A，G的平均含量分别为20.9%，25.7%，32.2%和21.2%，A+T含量为53.1%，高于G+C含量为46.9%(表 3).扩增得到12条巨魾的16S rRNA基因片段长度均为535 bp，得到4个单倍型，其中1号、4号、5号、6号、7号、9号、10号、11号、12号具有相同的单倍型.其中，简约变异信息位点0个；变异位点10个，约占全部位点的0.56%；保守位点532个，约占全部位点的99.44%.碱基T，C，A，G的平均含量分别为20.6%，22.6%，38.3%和18.5%，A+T含量为58.9%，高于G+C含量为41.1%(表 4).

    • 2.5.2.   12尾巨魾的遗传距离比较

  • 利用MEGA 5.0软件中的Kimura 2-Parameter[12]基于12S rRNA基因+16S rRNA基因序列计算12尾巨魾之间的遗传距离，获得12尾巨魾的平均遗传距离为0.002(表 5)；转换/颠换的平均值为3.065.

    • 2.5.3.   分子系统进化树

  • 本文利用邻接法(Neighbor-joining，NJ)基于12S rRNA和16S rRNA基因全序列对12种鮡科鱼类构建分子进化系统树(图 5).

    由NJ树可知，12种鮡科鱼类分成两大支：即鮡属、石爬鮡属、异齿鱼妟属汇聚成一支，支持率为99%；魾属、黑鮡属、原鮡属、纹胸鮡属、褶鮡属、凿齿鮡属汇聚成一支.黑鮡属与纹胸鮡属是姐妹群，支持率达到99%，其中巨魾单独成一支，支持率达到99%.黑鮡属与纹胸鮡属汇聚成一支.

    12种鱼类的科名，种属名见表 6，其中河口巨魾与澜沧江巨魾属于魾属，细尾鮡和扁头鮡属于鮡属，黑斑原鮡和原鮡属于原鮡属.

3.   讨论

    3.1.   巨魾的12S rRNA和16S rRNA基因序列的内部特征

  • 实验中扩增得到12条巨魾的12S rRNA基因片段长度为954 bp.序列比对得到同源序列954个位点.其中简约变异信息位点1个，约占全部位点的0.1%；变异位点8个，约占全部位点的0.8%；保守位点946个，约占全部位点的99.1%.扩增得到12条巨魾的16S rRNA基因片段长度为535 bp.其中变异位点有3个，约占全部位点的0.56%；保守位点532个，约占全部位点的99.44%；简约变异信息位点0个.由此可知，两者具有较高的保守性.

    12条巨魾的12S rRNA基因序列中T，C，A，G的平均含量分别为20.9%，25.6%，32.2%和21.2%；A+T含量为53.1%，G+C含量为46.9%；12条巨魾的16S rRNA基因序列中T，C，A，G的平均含量分别为20.6%，22.6%，38.3%和18.5%，A+T含量为58.9%，G+C含量为41.1%.以上数据中我们不难看出，12S rRNA基因和16S rRNA基因序列中都是A+T含量略高于G+C含量，本研究的结果与程国宝等[6]在梭鱼和鲻鱼中的研究结果相一致.

    12条巨魾的12S rRNA序列及16S rRNA序列中分别出现了6种及4种单倍型，童馨等[8]在100尾黄姑鱼的16S rRNA序列中出现2种单倍型，程国宝等[6]在梭鱼及鲻鱼的16S rRNA序列中分别出现了1种及2种单倍型，表明本研究巨魾的遗传多样性稍微高于黄姑鱼，梭鱼及鲻鱼群体.

    • 3.2.   9属12种鮡科鱼类12S rRNA与16S rRNA合并基因的分子系统进化树分析

  • 进行分子系统进化研究中，邻接法(NJ)是最常用的方法[13].由NJ树可知，本研究中所有鮡科不同的种类分成两大分支：即鮡属、石爬鮡属、异齿鱼妟属汇聚成一支，支持率为99%；魾属、黑鮡属、原鮡属、纹胸鮡属、褶鮡属、凿齿鮡属汇聚成一支.黑鮡属与纹胸鮡属是姐妹群，支持率达到99%，其中巨魾单独成一支，支持率达到99%，说明魾属与其他属之间的亲缘关系可能较远.黑鮡属与纹胸鮡属汇聚成一支，它们亲缘关系可能较近.亲缘关系较近的还可能是原鮡属与凿齿鮡属，异齿鱼妟属与鮡属，这与郭宪光[14]等人的研究结果相一致.

Figure (5)  Table (6) Reference (14)

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