Influence of pH and Different Concentrations of NaCl Solution on Schizothorax prenanit Sperm Vitality

实验鱼由重庆市巫溪县曙光农业科技开发有限公司提供，在4月份左右随机选择体格健壮、健康、吻部珠星明显、生殖孔突出微红、体质量平均在1.2 kg左右的雄性亲鱼作为试验鱼，然后进行人工注射催产素，暂养于催产池中.实验仪器及试剂有电子天平、酸度计、秒表、移液枪、光学显微镜等，在实验中用去离子水配制了34，51，68，85，102，119，136，153，170 mmol/L，即0.2%~1.0%共9个梯度百分浓度的NaCl溶液，用去离子水滴加盐酸和氢氧化钠(分析纯)调配了pH=3~11共9个梯度的pH值溶液.

齐口裂腹鱼雄鱼注射催产素后，观察亲鱼的发情状况，效应时间65 h左右，即可开始采精，试验水温为(14±1) ℃.采用干法采精，即采精前用毛巾擦干鱼体，防治精液遇水被激活.用亲鱼夹固定亲鱼，轻挤压雄鱼腹部，用干燥的离心管保存精液.在采集精液的过程中，要尽量避免精液受粪便、血及尿液的污染，样品保存在冰块环境中以待观察.

采精前准备好试验用的试剂和器材，调节好显微镜，方便能快速观察精子形态.在显微镜下，用解剖针挑起少量精液于载玻片中央的稀释液中搅匀，同时按下秒表开始计时，在显微镜视野中观察精子的运动状态.据文献报道^[9]，精子活动分为3个阶段：① 快速运动期，其特征是精子的运动状态呈旋涡状，而且快速运动看不清其形态；② 慢速运动期，其特征是精子运动速度明显比快速运动期减慢，且其形态、运动路线都能看清；③ 摇摆运动期，精子只能在原地颤动，不能曲线运动，直至90%以上死亡.精子寿命是指精子被激活起至绝大部分停止摇摆不运动所经历的时间.各阶段之间的界限，以一个视野中70%左右的精子由前一运动状态转为后一运动状态划分，精子的死亡则是以视野中95%左右的精子停止运动为标准.各项试验均重复3次，本次试验只记录精子快速运动时间和寿命.

试验所得数据均采用Excel和spss 20.0软件分析，所有数据均以平均值±标准差表示，采用S-N-K法进行多重比较以检验其差异是否具有统计学意义，p＜0.05表示差异具有统计学意义，p＞0.05表示差异不具有统计学意义.

不同pH值对齐口裂腹鱼精子活力影响结果见表 1.由表 1可以看出，齐口裂腹鱼精子对pH值的适应范围较广，当在pH≤4范围的稀释液中精子便不能存活，精液聚集成块凝固，加水稀释也没有活动迹象，当pH值超过9时，精子也不活动.其余pH值范围水中精子均能活动，特别对弱碱性水有较强的适应力，在pH=7的稀释液中精子激活后，强烈运动时间和寿命都较长，pH=7组的精子活力与pH=3~5和pH=8~11这几组相比，其快速运动时间和寿命的差异具有统计学意义(p＜0.05)，与pH=6和pH=8组差异不具有统计学意义(p＞0.05). pH值较低或较高的稀释剂中，精子的强烈运动时间缩短，活力相应减小，受精率都受到较大影响.因此，齐口裂腹鱼精子较适宜pH值为7左右，故建议在人工繁殖时，最好在pH=7左右的水体中进行.若酸性水体，使用前最好用生石灰调节水体pH值的至中性，人工授精时精液释稀剂的pH值也应以中性为宜，这样有利于增强精子活力，提高受精率.

不同百分浓度NaCl溶液(溶液pH值约为7) 对齐口裂腹鱼精子活力的影响见表 2.从表 2中可以看出，NaCl百分浓度在0.2%~0.5%时，随着NaCl百分浓度增大，齐口裂腹鱼精子的快速运动时间呈上升趋势，并且在0.5%处达最大，为(42.78±3.03) s，与其他组相比差异具有统计学意义(p＜0.05)，在0.2%~0.4% NaCl溶液之间，精子活力差异不具有统计学意义(p＞0.05). 0.5%NaCl溶液的精子激活率达90%以上，寿命相对较长，快速运动时间长，是人工授精稀释剂的理想NaCl百分浓度. NaCl百分浓度超过0.5%后，精子快速运动时间逐渐减小，超过0.7%后，精子被抑制，基本上没有被激活，加水稀释后精子被激活.经试验，齐口裂腹鱼精子在0.75% NaCl溶液中处于抑制状态，加水稀释后被激活，其快速运动时间平均为43 s，寿命平均为94 s.精液加在0.75%NaCl溶液，18 ℃下保存2 h后，在显微镜下观察精子处于抑制状态，加水稀释后精子被激活，激活率在80%以上，其快速运动时间为35 s，寿命为90 s，说明较高百分浓度的NaCl溶液可以作为齐口裂腹鱼精液的稀释剂，并可短时间保存精液且不影响其活力.

精子活力是评价精液质量的重要指标，是精液保存和人工授精等研究的基础.由于精子运动是细胞的一种运动方式，其运动机理的研究有较高的理论价值^[10].鱼类精液中由于精子过稠，缺乏氧气与水分，而二氧化碳浓度过高，因此精子在精液中是不活动的，但却有着极强的潜在活动能力.由于精巢中诸多因素的抑制作用，使得鱼类精子的成熟和储存得到很好的保障，这也正是很多雄性鱼在整个繁殖期内可以一直产出活力良好精子的主要原因^[11].低渗液和等渗液可以激活鱼类的精子.由于鱼类精子的能量储存极为有限，一旦被激活能量即被迅速消耗，因而相对于体内受精的哺乳动物来说，体外受精鱼类的精子寿命短暂，一般只有几十秒至几分钟，而哺乳动物可长达几个小时^[12].因此，在齐口裂腹鱼的人工繁殖过程中，要研究了解其雄鱼的精子活力，使得人工授精在精子活力最好时进行，有利于提高受精率，从而提高人工繁殖效果.

钠离子的主要生理功能是维持细胞内外渗透压平衡.很多鱼类精浆中含有较高百分浓度的Na⁺，该离子是造成鱼类精巢内环境高渗透压的主要离子之一^[11].从表 3可以看出，淡水鱼类精子被激活的最适NaCl百分浓度一般在0.3%~0.7%之间^[13-16]，范围较广，激活齐口裂腹鱼精子的最适NaCl百分浓度为0.5%，即在此浓度范围内.其中，激活鲥鱼精子的最适NaCl百分浓度与齐口裂腹鱼一样都为0.5%，但是快速运动时间和精子寿命都比齐口裂腹鱼长^[15].激活胭脂鱼精子的最适NaCl百分浓度为0.6%，其精子快速运动时间和寿命与齐口裂腹鱼相近^[16].

根据本实验结果，结合其他相关资料，作者认为Na⁺对鱼类精子活力的影响无论鲤科鱼类或是其他鱼类，都表现在其渗透压方面.精浆中通过Na⁺及其他离子形成高于外界的高渗环境，当精液排入水中后，精浆中Na⁺被稀释，精浆的高渗环境被破坏，使得精子激活.由于外界水体渗透压低于精子本身原生质，故该过程同时也是大量消耗精子自身能量的过程.所以，在鱼类人工授精过程中配制渗透压相近的NaCl稀释液，减少精子能量损失，延长精子持续活力时间，这对于提高受精率十分必要.本实验得到齐口裂腹鱼精子的等渗NaCl溶液在0.75%左右，故可以用0.8%~0.9%百分浓度的NaCl溶液做齐口裂腹鱼精液稀释剂室温暂时保存，且短时间内不会影响其活力.

pH值也是影响鱼类精子活力与寿命的重要因素.鱼类精子均适于在中性或偏碱性环境中活动，酸性环境会破坏精子细胞结构，使精子失活.从表 4可以看出，黄颡鱼、大黄鱼、石斑鱼等多种鱼类精子活力最强时的pH值均在7.5~9.0之间，即在弱碱性范围内.但像禾花鱼、大口鲇等鱼类精子活力最强时的pH值在6.5~7.0左右，即中性附近.本次实验中，齐口裂腹鱼精子活力在pH=7左右，快速运动时间较长，这一结果与一般淡水鱼类相一致.在人工授精的过程中，如若要添加精液稀释剂，稀释剂的pH值也应该在7左右，以保证精子被激活且有较强的活力，保证人工授精的成功，提高人工授精率.

渗透压是调节鱼类精子活力的主要因子.近年来的研究表明^[10]，鱼类精子激活比例随外界溶液渗透压的变化而变化，在一定范围内淡水鱼精子激活比例随外界溶液渗透压的降低而上升. Na⁺只是影响精子活力的其中一种离子，有研究报道Na⁺，K⁺是精浆的重要组成成分及形成精浆渗透压的主要离子，Ca²⁺是调节鱼类精子活力的重要因子，外界环境的Ca²⁺通过Ca²⁺通道进入精子细胞使精子细胞的Ca²⁺增加，是精子激活所必需的^[20]. Morisawa等^[21]发现鲑科鱼类抑制精子活动的主要因素不是高渗透压，而是浓度高出血浆很多倍的K⁺，当精液排入淡水使K⁺浓度降低，精子便被激活^[22].齐口裂腹鱼精子活力的影响因素，比如K⁺，Ca²⁺等离子的影响有待于今后研究.