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忍冬属(Lonicera Linn.)植物多为灌木、小乔木，部分为藤本，常绿或落叶，约有180种，主要分布在北非、亚洲、欧洲和北美地区.中国有忍冬属植物57种，其中23种为中国特有种[1].在本属植物中，忍冬(L. japonica)是中药金银花的药源植物；灰毡毛忍冬(L. macranthoides)、菰腺忍冬(L. rhytidophylla)、华南忍冬(L. confusa)和黄褐毛忍冬(L. fulvotomentosa)是山银花的药源植物[2]；同时还有许多具有优良观赏价值的种类，如贯月忍冬(L. sempervirens)和台尔曼忍冬(L. ×tellmaniana)等具有鲜艳的花色，且花期较长，可在园林绿化中广泛应用[3].
花色创新是花卉育种的重要内容[4]，而色素分析和呈色机理研究是基础. Chavoanalikit等[5]和Renáta等[6]测定蓝靛果忍冬(L. caerulea var. kamtschatica)果实类黄酮，检测到6种花青素苷和2种黄酮醇；Jordheim等[7]在7种忍冬属植物的浆果中检测出3种花青苷；Yuan等[8]从红白忍冬(L. japonica var. chinensis)花蕾中检测到8种矢车菊素(Cyanidin)型花青苷；付林江等[9]测定了金银花(忍冬)花蕾与花朵中总黄酮、叶绿素和类胡萝卜素以及细胞液pH值，并分析了花色变化的原因；刘安成等[10]对5种忍冬属植物花朵中的花青苷成分进行了定性和定量分析，检测出4种花青苷.但对忍冬属植物的红色、黄色花朵的花色素组成和含量变化研究较少.本试验以忍冬属5种藤本植物为材料，研究其开花过程中的花色、色素组成及含量变化，探讨花色和色素组成在开花过程中的变化规律，为忍冬属植物花色育种及功能利用提供参考.
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试验材料为忍冬(L. japonica)、火焰忍冬(L. ×heckrottii Rehd.Huoyan)、贯月忍冬(L. sempervirens)、格雷姆忍冬(L. periclymenum L. Geleimu)和台尔曼忍冬(L. ×tellmanniana).采集不同材料不同开花阶段的花朵，分别进行花色测定和花色素的提取和测定.花期分为初蕾、中蕾、膨大、初花、末花5个阶段.其中，膨大期为花将开，白色花的蕾明显发白，红、黄色颜色发亮；初花期为花始开到完全开放，初花期很短，一般持续时间为2~3 d；当白色的忍冬花朵变为黄色，或其他颜色的花朵内瓣明显发生变化，即进入末花阶段，中间没有明显盛花表现症状.以忍冬为例，花冠白色为初花期，花冠黄色为末花期，不另分盛花期.
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取不同开花阶段的新鲜花蕾或花瓣，参照Li等[11]方法，采用英国皇家园艺学会比色卡进行花色对比，并用分光色差仪进行明度L*值、色相的a*值、b*值的测量.筒状花外瓣颜色测定花筒上部膨大部位或裂瓣的中部，内瓣花色测定裂瓣部位颜色.忍冬花初花期和末花期内外瓣颜色基本一致，故只测定其外瓣颜色.每个样本测5朵花，求平均值.彩度C*值和色相角度h根据公式
${C^*} = {\left( {{a^{*2}} + {b^{*2}}} \right)^{1/2}}, h = \arctan \left( {{b^*}/{a^*}} \right) $ 计算.花筒外侧颜色测定初蕾到末花5个阶段，内侧颜色测定初花和末花2个阶段，并分别进行p=0.05水平下的SNK检验. -
参照文献[10, 12]进行色素成分提取，用移液器转出上清液后继续加入适量提取液重复浸提，混合浸提液，存于-20 ℃冰箱，供总花青苷、总黄酮的定性、定量分析.每个样本3次重复.
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将提取液经微孔滤膜(0.45 μm)过滤后进行测定.高效液相色谱系统和分析条件参照李崇辉等的方法[12].花青苷的检测波长为525 nm.流动相A为甲酸:水(10:90)，B为甲醇:乙腈(85:15).甲醇、乙腈为色谱级，水为双蒸水，甲酸为分析纯.线性梯度洗脱，通过跑样检测优化程序，最终确定洗脱程序为：0 min，5%B；20 min，15%B；25 min，30%B；35 min，5%B.
采用标准品半定量法测定总花青苷的含量[12-13].标准品为锦葵素3，5-O-葡萄糖苷(malvidin-3，5-diglucoside，Mv3G5G)，购于法国Extrasynthese公司.每个处理3个重复(下同).
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黄酮、黄酮醇的检测波长为350 nm.流动相A为甲酸:水(0.1:99.9)，B为甲酸:乙腈(0.1:99.9).线性梯度洗脱，程序如下：0 min，8% B；20 min，30% B；30 min，8% B.其他色谱条件同1.3.2.标准品为芦丁(槲皮素-3-芸香糖苷)，购自中国药品生物制品检定所.
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辅助色素效应指数(CI)依据公式CI=TF/TA计算[12].
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称取新鲜样本0.5 g左右，液氮研磨后加入5 mL配制的80%丙酮水溶液，4 ℃避光浸提24 h[14]，每隔8 h振荡30 s，高速冷冻离心机离心5 min(6 000 r/min，4 ℃)，取上清液供分析用.
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UV-vis双光束分光光度计(UV-4802，UNICO公司)，以80%丙酮水溶液为空白，分别测定波长663 nm、646 nm和470 nm下吸光值.按照Lichtenthaler[15]方法计算叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的浓度(Ca、Cb、Cx·c，mg/L)，Ca、Cb之和为总叶绿素的浓度，最后根据下式分别求出花瓣中叶绿素和类胡萝卜素的总质量分数：色素的质量分数(μg/g)=色素的浓度×提取液体积×1 000/样品鲜质量.
1.1. 试验材料
1.2. 花色测定
1.3. 类黄酮色素成分定量测定
1.3.1. 色素成分提取
1.3.2. 总花青苷(TA)含量的测定
1.3.3. 总黄酮、黄酮醇(TF)含量的测定
1.3.4. 辅助色素效应指数
1.4. 叶绿素和类胡萝卜素含量的测定
1.4.1. 提取方法
1.4.2. 定量分析
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试验结果看出，5种忍冬属植物从蕾期到末花期花色变化明显.火焰忍冬由初蕾期的紫红色转为红色，明度L*值增大，彩度C*和色相a*值变化保持一致；格雷姆忍冬初蕾期为绿色，随着花蕾膨大到开放由黄色变为金黄色，蕾期与花期，彩度C*和色相a*值、b*值变化显著；贯月忍冬蕾期为紫色，开放后为红色，花瓣内部初花为黄色，到末花期转变为红色；忍冬初蕾绿色，随着花蕾膨大，绿色退掉而成白色，花后期由白色变为黄色；台尔曼忍冬花瓣外部各阶段彩度C*和色相b*值变化不显著，花初开时花瓣内部为橘黄色，到末期则颜色加深为橘红色，变化明显(表 1).
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试验结果看出，所检5种忍冬属植物在开花过程中叶绿素a、b及总叶绿素质量分数都呈下降趋势.花蕾初期都含有较高的叶绿素，忍冬总叶绿素质量分数最高，为101.84 μg/g，火焰忍冬、格雷姆忍冬、贯月忍冬、台尔曼忍冬分别为91.04 μg/g，62.23 μg/g，44.19 μg/g，74.42 μg/g.忍冬初蕾明显呈现绿色，火焰忍冬花蕾下半部呈现绿色，而其他3种绿色不明显.随着花蕾膨大，绿色消退，转化为白色、黄色或者红色.蕾期各品种的叶绿素质量分数变化显著，蕾膨大期和开花期基本保持稳定，总叶绿素的质量分数与花蕾的绿色表现明显相关(图 1、图 2).
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忍冬和火焰忍冬初蕾期类胡萝卜素质量分数较高，分别为26.10 μg/g和19.33 μg/g，随着花蕾膨大到开花过程中呈先下降再增高趋势；贯月忍冬从蕾期到开花类胡萝卜素呈增加趋势，末花期达37.43 μg/g；格雷姆忍冬花蕾和开放花朵中类胡萝卜素变化不显著；台尔曼忍冬初蕾期质量分数(23.25 μg/g)比其他阶段高.各个种之间的类胡萝卜素变化没有明显的规律(图 3).
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贯月忍冬和火焰忍冬花都是红色，花青苷质量分数相对高于其他几种(图 4).贯月忍冬总花青苷从初蕾期到开花末期呈增加趋势，开花后期花冠筒内部及裂瓣内侧也呈现红色，花青苷质量分数达0.57 mg/g；火焰忍冬在中蕾期质量分数最高，为0.36 mg/g，该阶段花朵明显呈现紫红色，随着花朵开放，花青苷质量分数降低，花朵变为鲜艳红色；格雷姆忍冬总花青苷质量分数较低，与其在蕾膨大期带有明显红晕的变化趋势一致；忍冬花朵的各个开花阶段都未检出花青苷成分，与Yuan等[11]的检测结果一致，总花青苷的质量分数变化趋势与前期检测[10]一致.
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忍冬和火焰忍冬随着花蕾发育到开花过程中总黄酮、黄酮醇(TF)含量呈下降趋势，贯月忍冬和台尔曼忍冬TF质量分数在开花过程中变化不明显，忍冬和台尔曼忍冬在初蕾期质量分数高，分别为2.64 mg/g和2.36 mg/g；格雷姆忍冬TF质量分数呈先升后降变化，在花蕾膨大期最高，为3.09 mg/g(图 5).
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辅助色素效应即花青苷与辅助色素结合而呈现的增色效应及红移[16].在本试验中，火焰忍冬、格雷姆忍冬和台尔曼忍冬不同阶段花色辅助效应指数都大于5，特别是格雷姆忍冬辅助色素效应指数明显高于其他种类，表明其呈色起决定性作用.忍冬因不含花青苷成分，故无辅助色素效应指数比值(图 6).
上述分析表明，在开花过程中，5种忍冬属植物花色变化明显，花中有关色素的质量分数普遍发生着明显变化，说明花中各色素组分的相对含量影响花的呈色.
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花瓣中的色素组成和含量是影响花色形成的基本因素.以叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素、总黄酮、总花青苷的含量，以花色的L*，a*，b*和C*等几个参数作为因变量，通过多元线性逐步回归建立花色与各色素之间的回归方程，探讨花色呈现的主要控制因子.
由以上花色参数与色素组成之间的多元线性回归方程可以看出，明度L*与花青苷总含量和叶绿素a的含量呈负相关，即这些组分含量越高，花瓣的颜色越暗；色相a*值表示颜色由绿到红的变化，花青苷含量增加，颜色向红色相偏移，叶绿素b的含量增加颜色向绿色相增加；色相b*表示颜色由蓝向黄的变化，色相b*值与总花青苷、叶绿素a负相关，与类胡萝卜素和总黄酮和黄酮醇正相关；彩度C*表示颜色的艳丽程度，与叶绿素a负相关，与总黄酮和黄酮醇正相关.
2.1. 开花过程中的花色变化
2.2. 不同忍冬开花过程中花色素的变化
2.2.1. 叶绿素
2.2.2. 类胡萝卜素
2.2.3. 总花青苷
2.2.4. 总黄酮、黄酮醇
2.2.5. 辅助效应指数
2.3. 花色素与花色的关系
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不同色素种类及其含量的时空组合最终决定花色，但花色与花瓣所含色素的颜色并不完全相同.花色除了受花色素种类和含量影响外，还受液泡的pH值、辅助着色、金属离子络合作用及花瓣表皮细胞的性状等共同作用[17].红色、蓝色、淡紫色主要由花青素决定，花瓣的橙-红色系的呈色主要取决于花青素和类胡萝卜素的组成及比例[18].在本试验中，5种忍冬属植物在开花过程中，色素含量在不同阶段发生了明显变化.叶绿素在初蕾期对花色起决定作用，忍冬和格雷姆忍冬花蕾的绿色主要是叶绿素呈色，随着花蕾膨大，叶绿素含量迅速下降，导致绿色减退.付林江等[9]认为，忍冬花朵开放后由白色转变为黄色主要是类胡萝卜素的含量增加，本试验检测的忍冬初花期和末花期类胡萝卜素变化与此结论一致，由此可以推定格雷姆忍冬盛花期、忍冬末花期类胡萝卜素对呈色贡献较大.贯月忍冬和火焰忍冬等红色系花朵中花青苷含量高，也是呈现红色的主要物质基础.贯月忍冬总黄酮在盛花期含量最高，忍冬和台尔曼忍冬在初花期含量高，火焰忍冬的蕾期比开花后高，而格雷姆忍冬总黄酮在蕾膨大期最高，但随着花瓣的张开逐渐下降.格雷姆忍冬和台尔曼忍冬花色辅助效应指数都高于5，说明黄酮、黄酮醇的辅助色素效应显著[12].黄色花色素组成一般为类黄酮和类胡萝卜素[19-20]，本试验中格雷姆忍冬的类黄酮和类胡萝卜素含量相对较高，与此结论一致.本试验中的5种忍冬属植物随着花蕾膨大到开放，亮度L*值呈增加趋势，原因之一是花朵在从蕾期到开放过程中，花瓣面积的扩大速度比色素的合成速度要快，也可能导致单位面积色素含量下降[16].
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忍冬属植物不仅有供采摘花朵药用或茶用的忍冬栽培，也有花色鲜艳的观赏种类在城市园林及庭院中应用，且随着欧美一些优良观赏品种的引入，观赏种类的应用越来越广泛.忍冬属植物花色相对单调，培育不同花色和花型的新品种以丰富花色和提高观赏价值，一直备受国内外研究者重视.金银花作为传统中药具有悠久历史，同时也广泛应用于保健食品、凉茶等.通过进一步对同属其他种类植物花的活性成分、药理及毒性研究，忍冬属植物在花茶和功能应用上可能更具开发潜力.
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