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柑橘是世界第一大类水果，2022年全球柑橘种植面积达1 055.296万hm2，产量达16 630.34万t(FAO统计数据). 我国柑橘种植面积和产量均居世界首位，2022年分别为303.35万hm2和6 003.9万t(国家统计局数据)，常见种类为宽皮柑橘、甜橙、柚、柠檬和金柑. 目前国内柑橘类果实仍以鲜果销售为主[1]. 全国已经有10多个单品种(群)产量超过100万t，95%的成熟期集中在10月至翌年1月，与北方的苹果、梨上市期重叠，鲜果市场频繁出现区域性、季节性过剩、销售价低和产品滞销的现象[2]. 我国柑橘果实加工率不足10%[3]，且橘瓣罐头占据了加工量80%以上，成为我国在国际加工品市场上最具竞争力的产品[4]. 我国橙汁消费量的90%以上依赖进口，2020年进口量达6.85万t[5]，而加工原料果实价格高于0.6元/kg时进行榨汁就会亏本[6]，“榨汁不如买(进口)汁”的现象依然存在[7]，阻碍了柑橘汁加工业的发展. 因此，研发高值和多元化的柑橘加工产品、提高鲜果利用率，是保障柑橘产业健康发展的有效渠道.
水果加工成果酒，可避免鲜果成熟期的堆积，减少食品资源浪费，丰富我国低度健康酒的产品种类，提高原有水果的经济价值[8]. 据中国酒业协会报道，2022年非葡萄酒类规上企业果酒市场规模为262.31亿元，销售收入和利润分别占全国酿酒产业的2.76%和1.71%. 而2014-2020年非葡萄酒类的果酒产量则从1.756×108 L攀升至1.486×109 L，果酒产量与消费逐渐提升[9]. 我国的果酒人均年消费量仅为0.3~0.4 L，与全球果酒人均年消费量6 L相差近20倍[10]. 随着消费者健康意识提升和时尚的消费观念升级，加之柑橘原料果品种丰富、产量巨大，开展柑橘酒的精深加工前景广阔.
柑橘果酒质量与品种密切相关[11-13]，目前，以我国特色柑橘品种酿造的果酒产品，其营养品质和风味品质还未进行全面和深入的探究. 为了明确不同柑橘品种果酒的基本理化指标(包括酒精度、可滴定酸、pH值、总糖)，以及有机酸、氨基酸、总酚、总黄酮、色度和挥发性成分的差异，本研究选择品质优良、栽种面积大、不同类型和熟期的梁平柚、大雅、沃柑、长叶晚橙等品种进行发酵果酒的研制，期望通过柑橘果酒品质的对比分析，寻找更适合生产的高品质柑橘果酒的优良品种类型. 同时，也为柑橘不同品种的精加工和特色果酒类型的开发提供理论和技术支撑.
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柑橘样品包括：柚类(梁平柚)，杂柑类(大雅柑、沃柑)以及橙类(长叶晚橙)，其中梁平柚和长叶晚橙采自西南大学柑桔研究所，大雅柑和沃柑分别采自重庆璧山和云南丽江基地，采收日期为2023年3月. 试验所用试剂见表 1.
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LC20A型高效液相色谱仪，日本岛津公司生产；GCMS-QP2010气相色谱-质谱联用仪，日本岛津公司生产；Supelco 50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头，上海楚定分析仪器有限公司生产；T6新世纪紫外-可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司生产；LHS-50SC恒温恒湿培养箱，上海齐欣科学仪器有限公司生产；WZS-32手持式糖度计，上海仪电物理光学仪器有限公司生产；PB-10精密pH计，德国Sartorius公司生产.
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操作要点：取4种原料果汁，加入焦亚硫酸钾0.0374%，果胶酶0.02%，50 ℃水浴1 h. 调整糖比例为22%. 接种活化酵母CECO1 0.12%(质量分数)，置于30 ℃培养箱发酵10 d，过滤得到原酒(图 1).
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酒精度(酒精计法)，滴定酸(指示剂法，以柠檬酸计)，pH值(pH计测定)的测定方法参照国家标准《葡萄酒、果酒通用分析方法》(GB/T 15038—2006). 总糖(蒽酮比色法)的测定方法参照丁雪梅等[14]的方法并略作修改. 取0.5 mL样品，加入25 mL纯水，超声提取10 min后过滤，滤液定容至100 mL为提取液. 取稀释100倍的提取液1 mL，加入4 mL 2.0 g/L蒽酮硫酸试剂(80%的硫酸)，沸水浴10 min，620 mm下测定吸光度，根据标准曲线计算得到总糖浓度.
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取5 mL样品，溶于15 mL 80%乙醇-水溶液，75 ℃水浴0.5 h，定容至25 mL，9 000 r/min，离心30 min，取上清液，经0.22 μm尼龙滤膜过滤，上机检测. 色谱条件：C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，紫外检测器，波长为210 nm，进样量20 μL，流动相A为0.01 mol/L磷酸二氢钠溶液(pH值2.8)，流动相B为甲醇，A∶B=97∶3，流速1.0 mL/min.
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参照经骐源等[15]的方法略作修改. 取10 mL样品，溶于25 mL 0.1 mol/L盐酸溶液，超声处理30 min后离心取上清液进行衍生化处理. 衍生：取上清液2 000 μL，分别加入衍生剂A(精密量取PITC 2 mL，用乙腈定容至10 mL)500 μL和衍生剂B(精密量取三乙胺2 mL，用乙腈定容至10 mL)2 000 μL，室温暗处孵育1 h，加4 mL正己烷萃取2次，每次10 min，吸取下层溶液与80 μL醋酸溶液混合，过0.22 μm尼龙滤膜.
色谱条件：C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相A为乙腈-水(4∶1，V/V)，流动相B为0.1 mol/L乙酸钠溶液(pH 6.5)-乙腈(97∶3，V/V)，流速1 mL/min，检测波长254 nm，柱温36 ℃，进样量20 μL. 梯度洗脱：0~11 min，0%~1.5%A，100%~98.5%B；11~21.7 min，1.5%~7.6%A，98.5%~92.4%B；21.7~23.9 min，7.6%~11%A，92.4%~89%B；23.9~39 min，11%~30%A，89%~70%B；39~42 min，30%~70%A，70%~30%B；42~45 min，70%~100%A，30%~0%B；45~52 min，100%A，0%B；52~55 min，100%~0%A，0%~100%B；55~70 min，0%A，100%B.
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参照《枸杞中总酚含量的测定分光光度法》(T/NAIA 097-2021)并略作修改[16]. 5 mL样品匀浆用乙醇定容至50 mL，超声处理10 min，过滤. 取滤液1 mL加入25 mL比色管中，加入6 mL去离子水和1 mL 1.0 mol/L Folin-Phenol试剂，摇匀，放置6 min，再加4 mL 10.6%碳酸钠溶液，摇匀，静置60 min，用去离子水稀释至刻度，摇匀，测定在760 nm波长处的吸光度，进而计算总酚含量.
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参照李东香等[17]的方法. 用80%乙醇水将待测样品稀释5倍，超声处理30 min，过滤待用. 取滤液1 mL，置于25 mL比色管中，加5 mL 30%乙醇，1 mL 5%亚硝酸钠溶液，混匀，静置6 min；再加1 mL 10%硝酸铝溶液，摇匀，静置6 min；加10 mL 1mol/L氢氧化钠试液，加30%乙醇至刻度，摇匀，静置15 min. 以相应试剂为空白对照，在510 nm波长处测定吸光度，进而计算总黄酮含量.
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参照杨艳丽等[18]的方法略作修改. 取4 mL稀释8倍后的样品加入到15 mL样品瓶中，并加入60 μL的2-辛醇(8.19 g/L)内标物，1 g NaCl和磁力搅拌子，50 ℃下顶空萃取20 min，解吸5 min.
GC条件：色谱柱DB-5MS(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；升温程序：40 ℃保持3 min，以3 ℃/min的速率升到160 ℃，保持2 min，然后8 ℃/min升至230 ℃，保持3 min；氦气为载气流速为1.0 mL/min；无分流进样；进样口温度：250 ℃. MS条件：离子源温度250 ℃，传输线温度250 ℃，扫描速率全程35~450 m/z.
以2-辛醇为内标进行定量，由NIST 18.0数据库的相似度检索进行定性.
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参照杨艳丽等[18]的方法. 试验重复6次.
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将柑橘果汁和果酒样品采用SPSS 18.0对数据进行方差分析(analysis of variance，ANOVA)和Duncan多重检验；用Excel 2010对数据进行统计，试验结果用“平均值±标准偏差”表示，采用Origin 2018软件进行作图.
1.1. 材料与试剂
1.2. 仪器与设备
1.3. 试验方法
1.3.1. 发酵工艺
1.3.2. 原料及果酒基本理化指标分析
1.3.3. 有机酸分析
1.3.4. 氨基酸分析
1.3.5. 总酚含量分析
1.3.6. 总黄酮含量分析
1.3.7. 挥发性成分分析
1.3.8. 色泽分析
1.4. 数据分析处理
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4个品种果汁和发酵酒的酒精度、总糖、滴定酸、pH值见表 2. 柑橘果汁的总糖、滴定酸(除大雅柑和沃柑之间差异无统计学意义)和pH值差异有统计学意义. 4种柑橘发酵酒酒精体积比例之间差异有统计学意义(p＜0.05)：梁平柚酒精度最高，为(9.1±0.2)%；长叶晚橙酒精度最低，为(5.2±0.2)%；所有供试品种获得的酒精度在果酒酒精度范畴7%~18%的较低位置，长叶晚橙酒精度显著低于其他3个品种，推测与果汁的酸含量高有关. 4种果酒总糖质量浓度为34.7~42.7 g/L，符合NY/T1508-2007半甜型果酒的总糖指标. 本试验以柠檬酸代表发酵酒的滴定酸，4种果酒酸含量在梁平柚、大雅柑、沃柑(长叶晚橙)之间差异有统计学意义(p＜0.05)，沃柑和长叶晚橙差异无统计学意义(p＞0.05)，均在NY/T1508-2007总酸范畴. 不同品种柑橘酒的pH值都低于果汁且差异有统计学意义.
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有机酸是果品和果酒重要的风味物质[19]，果酒中酸的种类和质量浓度是果酒品质的重要因素，酸质量浓度影响酒的酒体以及果酒的颜色和稳定性，抑制杂菌的生长. 苹果酸有金属和青苹果的味道，柠檬酸清爽、温和、爽快，有新鲜感，后味延续时间短[20]. 由图 2可知，4个品种果酒分别检测出相同的6种有机酸种类，乙酸、柠檬酸、苹果酸是供试品种的主要有机酸. 梁平柚乙酸质量浓度最低，为2.060 g/L，与其他3个品种差异有统计学意义(p＜0.05). 苹果酸在梁平柚果酒种质量浓度最高，为1.585 g/L，是最低沃柑果酒0.174 g/L的9倍，4个品种间差异有统计学意义(p＜0.05). 柠檬酸在长叶晚橙果酒中质量浓度为1.517 g/L，大雅柑0.229 g/L，4个品种差异有统计学意义(p＜0.05). 乙酸质量浓度较高的原因与使用安琪酵母和发酵温度30 ℃有关.
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氨基酸是酒体风味的前体物质，具有丰富的味道[21]. 而发酵决定了氨基酸的种类，使得各种氨基酸比例更加协调[22]. 由表 3和图 3可知，4种柑橘果酒氨基酸种类和质量浓度表现出差异，梁平柚果酒数量最多，有18种，其次为大雅柑，有17种，沃柑和长叶晚橙共16种. 氨基酸质量浓度大雅柑最高，为7 170.60 mg/L，沃柑最低，为1 831.19 mg/L，最高质量浓度为最低的3.92倍. 供试的4个品种果酒中，必需氨基酸质量浓度以长叶晚橙最高，为373.55 mg/L，大雅柑必需氨基酸质量浓度最低，为232.53 mg/L. 4个品种果酒的呈味氨基酸分布各异，甜味氨基酸差异有统计学意义，最高为大雅柑，达1 507.24 mg/L，是最低长叶晚橙果酒的4.16倍. 4个柑橘果酒苦味氨基酸差异有统计学意义，沃柑苦味最低. 梁平柚和大雅柑鲜味氨基酸质量浓度分别为222.3 mg/L和211.16 mg/L，沃柑和长叶晚橙则较低，分别为57.81 mg/L和69.9 mg/L. 梁平柚和长叶晚橙果酒氨基酸从多到少依次为苦味氨基酸、甜味氨基酸、鲜味氨基酸；大雅柑和沃柑果酒呈味分布从多到少依次为甜味氨基酸、苦味氨基酸、鲜味氨基酸.
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酚类物质的含量高低影响果酒的风味和口感，且与果酒的抗氧化活性相关，是评价果酒风味及质量的重要指标[23]. 研究发现，不同品种果酒总酚含量与其抗氧化活性呈正相关. 酚类物质与果酒颜色、苦涩味相关，决定了果酒的整体口感[24]. 如图 4所示，不同品种果酒发酵后总酚含量差异无统计学意义(p＞0.05). 大雅柑总酚质量浓度最低，为568.33 mg/L，沃柑最高，为667.54 mg/L. 柑橘发酵酒的总酚质量浓度高于苹果、桃、猕猴桃等果酒[25-27]. 因此，柑橘果酒较高的总酚质量浓度决定了柑橘果酒较强的抗氧化能力.
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由图 5可以看出，总黄酮质量浓度以长叶晚橙果酒最高，为480.91 mg/L，显著高于其他品种(p＜0.05)；其次为大雅柑和沃柑，总黄酮质量浓度分别为325.29 mg/L和321.49 mg/L；最低的梁平柚也达到291.13 mg/L. 研究发现，品种、菌种、温度、接种量、SO2、pH值、金属离子等影响果酒发酵过程中黄酮质量浓度，此外ABTS，DPPH自由基清除能力和FRAP抗氧化能力均与黄酮质量浓度成正相关[28].
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由表 4可知，在果酒中共检出46种挥发性成分，包括酯类9种、醇类28种、醛酮类7种和其他2种. 其中，梁平柚和沃柑酒中各检测到25种挥发性成分，大雅柑和长叶晚橙酒中各检测到28种挥发性成分. 不同品种不同组分和含量各不相同，差异明显，2，4-二叔丁基苯酚、2-辛酮、(-)-4-萜品醇、5-甲基-2-庚醇是4种果酒共有且含量较高的挥发性成分. 如图 6所示，酯类化合物在4种果酒中差异有统计学意义(p＜0.05)，长叶晚橙相对质量浓度最高，为109.07 mg/L，依次为沃柑69.04 mg/L、梁平柚40.43 mg/L和大雅柑18.36 mg/L，辛酸乙酯、邻苯二甲酸二异丁酯、邻苯二甲酸二丁酯、N-羟基苯甲亚胺酸甲酯是几种果酒的主要酯类，辛酸乙酯在沃柑酒中含量较高，辛酸乙酯具有白兰地酒香气[29]. 醇类化合物各品种果酒质量浓度差异有统计学意义(p＜0.05)，沃柑达1 306.42 mg/L，长叶晚橙为1 119.81 mg/L，梁平柚最低，为434.24 mg/L，最高为最低质量浓度的3.01倍. 醇类物质在大雅柑、沃柑和长叶晚橙果酒中含量丰富，占所有挥发性成分的50%以上，是其主要香气成分，散发出诱人的令人愉悦的甜香和清香[30]. 5-甲基-2-庚醇在长叶晚橙中质量浓度高达323.97 mg/L，沃柑中也有较高质量浓度，为312.66 mg/L，梁平柚中质量浓度为73.74 mg/L，而大雅柑未检出. (-)-4-萜品醇质量浓度除梁平柚较低，为86.56 mg/L，大雅柑、沃柑和长叶晚橙质量浓度均较高，依次为190.42 mg/L，192.6 mg/L，193.37 mg/L. 4-萜品醇具有百合花香、清香，它的含量对果酒感官强度的增加有明显的促进作用[31]. 苯乙醇具有清甜的玫瑰花香，并有杀菌作用[32]. 异戊醇表现为水果香、醇香、刺激味，在沃柑果酒中质量浓度较高，为190.63 mg/L，且为沃柑独有. 醛酮类化合物中2-辛酮是梁平柚、大雅柑、沃柑和长叶晚橙4种果酒共有且最多的酮类物质，分别占据了各自醛酮类物质的90%，97%，93%，91%. 2-辛酮为无色至淡黄色液体，似苹果香气，在沃柑中质量浓度最高，为501.36 mg/L，与其他几个产品差异有统计学意义(p＜0.05). 2，4-二叔丁基苯酚在沃柑果酒最为突出，大多来源于纤维素等的热解，呈现出一种烟熏、药香的特殊香[33]，可用作抗氧剂、紫外线吸收剂以及多种光稳定剂、抗氧化剂的重要中间体. 4个品种果酒的挥发性物质丰富而各具特性，可使香气浓郁饱满，因原料不同具有高辨识度，又因独有的香气组分和含量，存在特异性差异.
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果酒的颜色主要来源于原料，L值反映果酒的亮度，a值的正负代表果酒色泽的红绿偏向，b值正负反映果酒颜色的黄蓝偏向. 如表 5所示，所有果酒的亮度都非常高，其中长叶晚橙的亮度最高，L*值为23.57，其次是沃柑和梁平沙白柚，大雅柑的亮度最低. 4种柑橘果酒的红色度差异不明显，大雅柑最高，长叶晚橙偏向负值，说明其色度轻微接近绿色. 供试品种整体黄色度都偏高，但长叶晚橙的黄色呈现程度最佳. 综上所述，长叶晚橙具有优良色泽，其黄色度明显最高，这可能是由于其所含的黄酮类化合物呈现黄色.
2.1. 不同柑橘果汁及果酒基本理化及品质分析
2.2. 不同品种柑橘果酒有机酸差异
2.3. 不同品种柑橘果酒氨基酸差异
2.4. 不同品种柑橘果酒总酚差异
2.5. 不同品种柑橘果酒总黄酮差异
2.6. 不同品种柑橘果酒挥发性成分差异
2.7. 不同品种柑橘果酒色泽差异
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果酒的品质与发酵过程、菌株、发酵的温度、原料的糖酸含量和糖酸比密切相关，而原料是决定葡萄[34-35]、樱桃[36]、猕猴桃[37]等多种果酒的首要因素. 柑桔果实包含桔、柑、橙、柚、柠檬、金柑等，不同类型之间的颜色、理化品质和营养成分差异有统计学意义. 邓秀新等[38]对200多个品种进行记述，果实品质各具特色，颜色有黄、橙黄、橙红、朱红等，朱丽莎等[39]分析甜橙中的脐橙、普通甜橙和血橙等25个品种，筛选出清家脐橙类黄酮含量较丰富、脐血橙酚酸物质含量较丰富. 陈细羽等[40]对7个杂柑(宽皮柑橘类)品种进行不同组织部位的营养功能成分测定，发现不同品种、不同部位的营养功能成分存在差异，沃柑具有较好潜力. 本研究采用相同的发酵工艺，对不同基因来源的4个柑橘果酒理化、营养、功能、色泽等方面进行比较分析，发现4个品种果酒相互之间的酒精度、pH值、氨基酸含量差异有统计学意义，总酚、色泽差异无统计学意义，总黄酮、酯类、醇类和醛酮类部分品种间差异有统计学意义. 梁平柚果酒可以获得较高的酒精度，而滴定酸和pH值显著低于其他品种，可以获得丰满醇厚酒体的果酒，与易鑫等[41]研究结果一致. 大雅柑果酒偏向橙红色，氨基酸总量和甜味氨基酸高于其他品种，差异有统计学意义；总酚和总黄酮含量均较高，抗氧化活性较强. 沃柑的酒精度、含酸量、亮度、总酚和总黄酮均呈现较好的特征，挥发性物质组分赋予了沃柑果酒独享和突出的多种成分，如异戊醇(水果醇香)，苯乙醇(玫瑰香味)、2-辛酮(苹果香气)、辛酸乙酯(白兰地酒香)，2，4-二叔丁基苯酚(药香抗氧化)等，香味丰富，与其果实的优良品质一致[40]. 长叶晚橙果酒亮度和黄色程度最高，含有丰富的多酚，必需氨基酸、总黄酮显著高于其他品种，是一种理想的功能果酒，但酒精度比较低，可考虑更换发酵剂、调整发酵温度提升酒精度以加重酒体. 本研究中酒精度均偏低，可能与发酵时间(10 d)偏长有关，付勋等[42]研究发现，发酵7 d酒精度最高且综合评分最好.
综上，4个品种果酒的特点鲜明，梁平柚(柚类)适宜酒体浓郁型果酒；大雅柑(甜橙、温州蜜柑、椪柑杂交后代)适宜颜色鲜美的功能性果酒；沃柑(橘橙、红橘杂交后代)功能性较强，适宜迷幻香味的果酒；长叶香橙(晚熟甜橙)可开发为低醇功能性果酒. 鉴于果品品质与果酒品质的评价指标不一样，本研究选用优良品种和品质柑桔果实进行果酒探索，意在改变加工原料采用残次果或伤烂果的误区，用高质量的原料生产高品质的酒品. 但本研究仅用相同工艺的果汁进行果酒制备试验，未进行发酵工艺、发酵菌株等比较试验，也未利用不同果实种类和果实不同部位之间的功能营养差异进行比较试验，今后将进一步细化研究，为柑桔果酒产业化提供理论支撑和更细分的品质依据.
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