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2022 Volume 47 Issue 2
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HU Kete, ZHANG Ping, CHEN Rongxiang, et al. Effect of Exogenous Plant Hormones on Content of Secondary Metabolites in the Leaves of Rhus Chinensis and on Their Antioxidant Activities[J]. Journal of Southwest China Normal University(Natural Science Edition), 2022, 47(2): 43-49. doi: 10.13718/j.cnki.xsxb.2022.02.009
Citation: HU Kete, ZHANG Ping, CHEN Rongxiang, et al. Effect of Exogenous Plant Hormones on Content of Secondary Metabolites in the Leaves of Rhus Chinensis and on Their Antioxidant Activities[J]. Journal of Southwest China Normal University(Natural Science Edition), 2022, 47(2): 43-49. doi: 10.13718/j.cnki.xsxb.2022.02.009
shu

Effect of Exogenous Plant Hormones on Content of Secondary Metabolites in the Leaves of Rhus Chinensis and on Their Antioxidant Activities

  • 1.

    School of Basic Medical Sciences, Zunyi Medical University, Zunyi, Guizhou 563000, China

  • 2.

    Nuclear Medicine of The Third Affilicated Hospital of ZunYi Medical University, Zunyi, Guizhou 563000, China

  • 3.

    Zunyi Engineering Technology Research Center of Physical and Chemical Analysis, Zunyi, Guizhou 563000, China

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  • Corresponding author: GU Ding
  • Received Date: 07/12/2020
    Available Online: 20/02/2022

  • MSC: S718.5

  • The effect of exogenous plant hormones auxin3-indoleacetic acid (IAA), cytokinin 6-benzylaminopurine (6-BA), gibberellic acid (GA3) and their mixtures on content of polyphenols in leaves of Rhus chinensis was investigated. Ethanol solution was used as the blank control. The leaves were collected by every 5 days and their contents of total phenols were measured. The results show that IAA, 6-BA and GA3 increased significantly the total phenol content in leaves of R. chinensis at concentrations of 50, 30 and 30 mg/L, respectively. The highest accumulation of total phenols of R. chinensis leaves separately sprayed IAA, 6-BA, and GA3 appeared on 15th, 10th and 15th day, respectively, which increased by 46.54%, 48.48%, and 70.58%, respectively, compared with the control group. Moreover, when leaves were sprayed by IAA+GA3, IAA+6-BA, 6-BA+GA3, and IAA+6-BA+GA3, their highest growth rate of total phenol content occurred on 10th, 10th, 10th and 15th day and increased by 42.27%, 52.73%, 33.07% and 74.37%, respectively, compared with the control group. These results suggest that the optimal concentrations of IAA, 6-BA and GA3 for increasing the total phenol content of R. chinensis leaves were 50, 30 and 30 mg/L respectively. Compared with being sprayed by single hormone, R. chinensis leaves sprayed by the hormones' mixtures had higher total phenol content. The result of antioxidant analysis also show that the antioxidant activity of the leaves sprayed by the hormones' mixtures is higher than that of the control group. All these results indicate that exogenous plant hormones can effectively increase the content of total phenols in the leaves of R. chinensis, Ultrahigh performance liquid chromatography (HPLC) showed that exogenous phytohormones could improve leaves of R. chinensis antioxidant properties mainly by increasing the content of rhizosperidin and gallic acid.
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通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com
  • 1. 

    沈阳化工大学材料科学与工程学院 沈阳 110142

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Effect of Exogenous Plant Hormones on Content of Secondary Metabolites in the Leaves of Rhus Chinensis and on Their Antioxidant Activities

    Corresponding author: GU Ding
  • Received Date: 07/12/2020
  • Available Online: 20/02/2022

Abstract: The effect of exogenous plant hormones auxin3-indoleacetic acid (IAA), cytokinin 6-benzylaminopurine (6-BA), gibberellic acid (GA3) and their mixtures on content of polyphenols in leaves of Rhus chinensis was investigated. Ethanol solution was used as the blank control. The leaves were collected by every 5 days and their contents of total phenols were measured. The results show that IAA, 6-BA and GA3 increased significantly the total phenol content in leaves of R. chinensis at concentrations of 50, 30 and 30 mg/L, respectively. The highest accumulation of total phenols of R. chinensis leaves separately sprayed IAA, 6-BA, and GA3 appeared on 15th, 10th and 15th day, respectively, which increased by 46.54%, 48.48%, and 70.58%, respectively, compared with the control group. Moreover, when leaves were sprayed by IAA+GA3, IAA+6-BA, 6-BA+GA3, and IAA+6-BA+GA3, their highest growth rate of total phenol content occurred on 10th, 10th, 10th and 15th day and increased by 42.27%, 52.73%, 33.07% and 74.37%, respectively, compared with the control group. These results suggest that the optimal concentrations of IAA, 6-BA and GA3 for increasing the total phenol content of R. chinensis leaves were 50, 30 and 30 mg/L respectively. Compared with being sprayed by single hormone, R. chinensis leaves sprayed by the hormones' mixtures had higher total phenol content. The result of antioxidant analysis also show that the antioxidant activity of the leaves sprayed by the hormones' mixtures is higher than that of the control group. All these results indicate that exogenous plant hormones can effectively increase the content of total phenols in the leaves of R. chinensis, Ultrahigh performance liquid chromatography (HPLC) showed that exogenous phytohormones could improve leaves of R. chinensis antioxidant properties mainly by increasing the content of rhizosperidin and gallic acid.

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  • 盐肤木(Rhus chinensis Mills)为漆树科盐肤木属落叶小乔木，是我国重要的林业经济植物[1]，其茎和根常用于制作中药[2-3]，我国重要的中药材五倍子也是由瘿绵蚜科某些昆虫寄生于其中几种植物复叶上而形成的瘿瘤[4]. 五倍子所含酚酸类物质是一种具有诸多用途的天然产物，常被用作医疗与水产渔业[5-7]，具有抗氧化、抗辐射、抗肿瘤等生物活性[8-10]，其中主要成分没食子酸具有改善脑缺血再灌注损伤，改善心衰引起的心功能障碍和纤维化的功效[11-12]. 然而，目前五倍子酚酸获取途径比较单一，即主要是用五倍子提取. 近年来，由于自然环境遭到破坏而导致自然生长的虫瘿越来越少，从而使五倍子的产量越发降低，进而无法满足市场的需求[13]. 较五倍子而言，盐肤木叶片则相对资源丰富且易于获得，因其中也含有一定量的五倍子酚类化合物[14-16]而具有较大的潜在价值. 随着对植物虫瘿的研究，发现虫瘿的形成与植物激素有关[17]，前期研究发现五倍子与盐肤木中内源植物激素存在显著差异，并有研究发现喷施赤霉酸(GA3)能够使五倍子体积增大[18]，那么能否通过喷施外源性植物激素直接提高盐肤木叶片的多酚质量分数呢？通常酚类化合物的质量分数在五倍子(含倍花)中是盐肤木叶片的5~13倍[19]，倘若喷施外源性植物激素能提高盐肤木叶片的没食子酸等质量分数，即可从叶片中提取其有用化合物，从而使多酚的获取摆脱对倍蚜和五倍子的依赖，进而促进我国酚酸化合物相关产业的发展. 此外，还将为植物酚类代谢的相关研究提供参考. 为此，笔者初步研究了外源性植物激素对盐肤木叶片次生代谢产物积累的影响，以期寻求一条替代从五倍子中获取酚酸的途径，并探究其抗氧化活性改变的情况，以及外源性植物激素主要调控何种盐肤木次生代谢产物而影响其抗氧化性，以期发现其更多的应用价值.

1.   材料与方法

    1.1.   主要仪器与试剂

  • 紫外可见分光光度仪(Lambda265)，铂金埃尔默仪器有限公司; 电热鼓风干燥箱(GZX-9070MBE)，上海博讯实业有限公司医疗设备厂; 超高效液相色谱仪(UltiMate 3000 Bio—RS型)，赛默飞世尔科技有限公司; 万分之一电子天平(ME104/2)，梅特勒-托利多; 纯水及超纯水系统(Chorus)，英国埃尔格.

    无水乙醇(95%)，成都市科隆化学品有限公司; 福林酚，飞净生物科技有限公司; 生长素3-吲哚乙酸(IAA，CAS: 87-51-4，纯度≥98%)，细胞分裂素N-6-苄基腺嘌呤(BA，CAS: 12-14-39-7，纯度≥98%)，赤霉酸(GA3，CAS: 77-06-5，纯度≥90%)，北京绿泽森生物技术有限公司; 甲醇、乙腈、柠檬酸(色谱纯)、没食子酸标准品、无水碳酸钠、DPPH自由基、ABTS二铵盐、过硫酸钾，阿拉丁生化科技股份有限公司.

    • 1.2.   实验方法

    1.2.1.   植物材料及其处理

  • 采用完全随机实验设计，使用IAA，6-BA，GA3 3种激素处理盐肤木叶片，每种激素处理设置3个浓度梯度10，30，50 mg/L，再以混合激素处理设置同一浓度，即采用植物激素IAA，6-BA，GA3，其浓度为IAA 50 mg/L+6-BA 10 mg/L，IAA 50 mg/L+GA3 10 mg/L，6-BA 10 mg/L+GA3 10 mg/L，IAA 50 mg/L+ 6-BA 10 mg/L+GA3 10 mg/L; 以乙醇溶液处理为对照(CK)共计14个处理. 先将植物激素溶解于95%的无水乙醇中，再用蒸馏水分别稀释至所需浓度，其中酒精浓度为5%.

    2020年6月23日9：00(天气晴)，使用各处理溶液各100 mL喷施叶片，共喷施5 d，单次组合共计喷施500 mL，在第6 d采集叶片，之后每隔5 d采集1次叶片，共采集4次，采集时间为早上9：00，采集完毕立即带回实验室105 ℃杀青备用，然后于60 ℃烘干.

    • 1.2.2.   多酚提取

  • 精确称取0.1 g盐肤木叶片粉末，采用80%甲醇溶液超声提取多酚. 提取条件: 料液比为1∶100(g/mL)，在16 ℃水中超声提取50 min，冷却，取1 mL于EP管中在12 000 r/min离心10 min，取上清，然后0.22 μm滤膜过滤.

    • 1.2.3.   多酚测定

  • 提取方法参照1.2.2，然后稀释10倍，采用福林法[20]，取样品液0.5 mL，加入0.25 mol/L福林酚试剂0.5 mL，混合静置3 min，加入15% Na2CO3 1 mL混合静置30 min，12 000 r/min，离心10 min，取上清，以未加样品的对照组为空白，测定760 nm处的吸光度，建立没食子酸标准曲线，将吸光度带入公式计算没食子酸标准品浓度：

    式中，Y为吸光度，X为没食子酸标准品浓度.

    • 1.2.4.   抗氧化性对比

  • 酚类物质是盐肤木叶片中主要的抗氧化成分，而多酚浓度与抗氧化性存在正相关，故将总酚相对质量分数最多组设为A组，空白组设为B组，使用3种抗氧化性实验比较其抗氧化活性是否存在显著差异，并以此探究其多酚质量分数是否真正发生改变.

    • 1.2.4.1.   对DPPH自由基的清除

  • 参考文献[21]，取DPPH 1 mg，与有机溶剂定容至25 mL，混合震荡可得浓度为0.04 mg/mL的母液. 取2 mL母液，设置浓度梯度加入样品液并补加有机溶剂定容至1 mL，室温反应30 min，于517 nm处测定吸光度(A)，空白以1 mL有机溶剂代替样品液，计算清除率(I):

    式中，A试样为样品液的吸光度值，A空白为空白组的吸光度值.

    • 1.2.4.2.   对ABTS自由基的清除

  • 参考文献[22]，取ABTS二铵盐3 mg溶于0.8 mL双蒸水与1 mg过硫酸钾溶于1.5 mL蒸馏水中，暗反应氧化12 h，稀释30倍可得母液，取母液2 mL，与设置好浓度梯度的样品液1 mL暗反应30 min，于734 nm处测定吸光度，空白以1 mL有机溶剂代替样品，计算清除率(I).

    • 1.2.4.3.   铁还原能力

  • 参考文献[23]，以多酚浓度为x轴，吸光度为y轴，在593 nm处测定吸光度，比较不同处理盐肤木叶片的多酚铁还原能力.

    • 1.2.5.   对A组和B组进行多酚及类黄酮测定

  • 采用色谱柱: ACQUITY UPLC HSS T3柱(2.1 mm × 100 mm，1.8 μm); 流动相条件: 50 mmol/L柠檬酸盐溶液(pH值为2.9)与甲醇，按以下梯度洗脱: 0~14.5 min，10%~35%柠檬酸盐溶液; 之后采用40% 柠檬酸盐冲洗2 min后回到初始梯度并平衡4 min，柱温30 ℃，进样体积1 μL，DAD检测波长为275 nm.

    • 1.2.6.   数据处理与分析

  • 采用Excel 2003，SPSS 17.0软件进行数据统计与分析，prism 8软件作图，每次测量均重复3次.

2.   结果与分析

    2.1.   标准曲线绘制

  • 根据不同没食子酸标准品浓度下，对应吸光度的测定结果绘制标准曲线如图 1，线性回归方程为Y=17.611X+0.002，R2=0.999 7，其中Y为吸光度，X为没食子酸标准品浓度.

    • 2.2.   喷施不同植物激素对盐肤木叶片多酚的影响

  • 不同种类及浓度激素处理后盐肤木多酚质量分数结果见图 2. 由图 2d中可知，与对照组相比，3种激素混合组显著提高了叶中多酚的质量分数(p < 0.05)，见效较快. 计算得出在处理15 d时出现了最大增长率，持续时间长，在喷施后10~15 d都有不错的效果，其余促进效果依次为IAA+6-BA，IAA+GA3，GA3+6-BA，其中GA3+6-BA组合在5 d内为抑制，5 d后为促进.

    图 2a中，高浓度IAA(50 mg/L)显著提高了叶中多酚的质量分数(p < 0.05)，见效较快; 随着IAA浓度增高，多酚质量分数随着增高，在15 d时增长最显著(p < 0.05)，在第20 d，10 mg/L和30 mg/L与对照相比差异无统计学意义(p＞0.05).

    图 2b中，中等浓度6-BA(30 mg/L)显著提高了叶中多酚的质量分数(p < 0.05)，见效快; 在处理第10 d时增长达到极值，10 mg/L组和50 mg/L组在5 d时与对照差异无统计学意义(p＞0.05). 在10 d时多酚质量分数提高，其中10 mg/L组持续时间较长，在10~15 d均有不错的效果. 在第20 d，3种浓度梯度与对照差异无统计学意义(p＞0.05).

    图 2c中，中等浓度GA3(30 mg/L)显著提高了叶中多酚的质量分数(p < 0.05)，见效较快; 在15 d时增长达到峰值，仅在第10 d效果不如50 mg/L组，3种浓度均有较好的促进盐肤木叶中多酚质量分数的效果.

    • 2.3.   抗氧化分析比较

  • 由2.2结论选择第15 d全喷组为A，第15 d对照组为B进行抗氧化分析和比较.

    • 2.3.1.   DPPH自由基清除能力

  • 由图 3可以看出，盐肤木叶质量浓度在20~120 mg/L时与DPPH自由基清除率成正相关，IC50表示半清除率，即A组IC50为49.70 mg/L，B组IC50为79.90 mg/L，A组DPPH清除率明显高于B组，即可推测A组多酚质量分数高于B组.

    • 2.3.2.   ABTS自由基清除能力

  • 由图 4可以看出，盐肤木粉末质量浓度在2~12 mg/L时与ABTS自由基清除率成正相关，A组IC50为2.15 mg/L，B组IC50为4.77 mg/L，可以推测A组多酚质量分数高于B组.

    • 2.3.3.   铁离子还原能力

  • FRAP法的原理是抗氧化剂将Fe3+还原成Fe2+，其与FRAP试剂结合，在593 nm处具有最大吸收峰，吸光度越大，铁离子还原性越好. 由图 5可以看出，多酚质量浓度在20~100 mg/L之间与铁离子还原能力成正相关，可以推测A组多酚质量分数高于B组.

    3次抗氧化实验均显示A，B两组具有显著的抗氧化性，A组抗氧化能力显著高于B组，可推测A组多酚质量分数高于B组，与2.2结果相符.

    • 2.4.   A，B组的主要次生代谢产物质量分数测定及分析

  • 为探究植物激素促进了何种酚类化合物的合成，并使盐肤木叶抗氧化性增强，笔者采用超高效液相色谱对提取物进行检测，结果见表 1，分离出的盐肤木主要成分见图 6.

    结果显示盐肤木叶中共检测出6种主要成分，除没食子酸甲酯、没食子酸乙酯外，其余成分均有显著增高，其中根皮苷、没食子酸质量分数增高较为显著，也即是指混合植物激素主要是通过提高根皮苷与没食子酸质量分数增加其抗氧化性，而喷施混合植物激素对没食子酸甲酯和没食子酸乙酯的影响不大.

3.   结论与讨论

  • 本研究通过直接测量与间接比较表明，IAA，6-BA，GA3具有促进盐肤木酚类化合物积累的效果，并且受到激素种类、激素浓度和处理时间等因素的影响. 在本实验条件下，IAA，6-BA，GA3的最适宜质量浓度分别为50，30，30 mg/L; 相比对照组，多酚最高增长率分别出现在第15，10，15 d，3种激素混合能达到更好的效果，其抗氧化性得到显著提高，具有一定的应用意义.

    不同植物激素之间的相互调节，在植物生长发育中起着关键作用. IAA的主要作用是促进细胞伸长、诱导和促进细胞分化[24]. 本研究结果表明，不同浓度的IAA均能够提高盐肤木叶的多酚质量分数，其中高浓度的IAA(50 mg/L)是较适宜的浓度，此浓度在喷施5~20 d均有不错的效果. 在使用Qtrap 6500质谱仪发现五倍子中的IAA是叶片中的7.48倍，说明植物保持高水平的IAA有助于酚酸物质的积累. 6-BA属于人工合成细胞分裂素，在次生代谢产物的合成和积累以及应激反应过程中发挥着重要的作用[25]. 本实验结果表明中等质量浓度的6-BA(30 mg/L)是提高盐肤木叶多酚质量分数的适宜浓度，在5~15 d的盐肤木多酚质量分数显著增高，其中原因可能是中等浓度的6-BA溶液提高了叶片中细胞分裂素的水平，抑制并清除了自由基，增强了光合作用[26]. 有研究表明6-BA有助于提高沙枣愈伤组织中缩合鞣质的积累[27]. GA3是能够加速细胞分裂与生长、促进植物生长、抑制植物器官衰老的植物生长调节剂[28]. 本实验结果表明，不同浓度的GA3各采样时间的盐肤木叶多酚质量分数均有不同程度的提升，以30 mg/L效果最佳. GA3已被证实是生长素运输所必须的激素[29]，另有研究表明GA3能促进丹参毛状根中多酚的积累[30]，并且GA3在其悬浮培养细胞中也能促进酚类化合物的形成[31]，与本研究结果相符.

    本研究通过直接测量多种植物激素刺激下盐肤木叶多酚质量分数并且通过3种抗氧化实验加以验证，即喷施激素组酚酸质量分数高于对照组，表明适当的外源性植物激素有助于提高盐肤木叶片的次生代谢物质量分数，其中没食子酸为五倍子中的主要成分，这可能使“喷施外源性植物激素提高盐肤木叶片的酚酸质量分数，并直接从叶片中提取酚类化合物，从而使酚类的获取摆脱对倍蚜和虫瘿的依赖”的设想得以实现，进而有利于促进我国酚类化合物相关产业的发展; 同时，还将为植物次生代谢及提高抗氧化性的相关研究提供新的思路. 进一步研究发现以根皮苷、没食子酸及其衍生物为首的类黄酮及多酚类化合物受植物激素影响变化较大. 在既往的研究中[32-34]，根皮苷与没食子酸具有良好的抗氧化性及药用价值，希望此研究能为类似研究提供参考. 本研究初步确定了对盐肤木叶片喷施外源性植物激素能提高酚酸质量分数，但后续还需在理论方面弄清植物激素与盐肤木叶片酚酸积累之间的关系及其机制.

Figure (6)  Table (1) Reference (34)

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