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百合是百合科(Liliaceae)百合属(Lilium)植物的统称，最早载于《神农本草经》，性味甘寒，具有养阴清肺、清心安神之功，用于治疗阴虚久咳、虚烦、失眠等症. 《中华人民共和国药典(2015年版)》收载的百合为百合科植物卷丹(Lilium lancifolium Thunb)、百合(L.brownii F. E. Brown var. Viridulum Baker)、细叶百合(L. Pumilum DC)[1]. 百合生长季节易发生病虫害，常见病有病毒病、百合疫病、软腐病、灰霉病等[2-3]. 目前，我国在百合上仅登记了苯醚甲环唑和氟硅唑2种杀菌剂[4]，但在实际生产中，由于百合连作障碍严重，可能会使用其他杀菌剂进行病害防治. 其中，咪鲜胺在防治植物病害方面表现优异，且具有防治谱宽、低毒、见效快等优点[5].
咪鲜胺是咪唑类农药中的一种广谱性杀菌剂，能够抑制病原菌中麦角甾醇的生物合成，对多种半知菌和子囊菌病害均有显著控制效果，可防治稻瘟病、赤霉病、青绿霉病、炭疽病、褐斑病、黑腐病等病害[6-9]. 有研究表明，咪鲜胺在水果中降解后的最终主要代谢产物为2，4，6-三氯苯酚[10]. 而2，4，6-三氯苯酚被人体摄入后可能会在脂质组织中累积，对人的神经和呼吸系统造成影响，严重时甚至可能引发淋巴瘤和白血病等[11]. 另外，2，4，6-三氯苯酚还易造成环境污染，已被欧盟环境协会和美国环保署列入环境污染物清单[12]. 关于咪鲜胺在水果和蔬菜中的残留检测方法和残留动态行为，国内外已有报道，刘骞等[13]发现丝瓜中的咪鲜胺残留量最大时为0.36 mg/kg，原始沉积量低，3 d后便检测不出咪鲜胺残留量；冯义志等[14]发现45%咪鲜胺微乳剂在葱中的消解速度较快，半衰期为5.3~6.3 d；连秀叶等[15]发现5%咪鲜胺乳油在荔枝果实中的原始沉积量为0.093 6 mg/kg，半衰期为2.2 d；刘骞等[16]发现45%咪鲜胺水乳剂在芹菜中的半衰期为6.1~6.8 d，而咪鲜胺在姜植株内的残留量在30 d内基本没有变化，没有明显降解；杜文瑜等[17]发现，在常温和冷藏条件下，咪鲜胺在哈密瓜中的半衰期分别为3.8和4.5 d，代谢物2，4，6-三氯苯酚在贮藏期间含量呈增加趋势. 然而，咪鲜胺在中药材中的残留研究相对缺乏. 本研究拟建立百合中咪鲜胺及其代谢物2，4，6-三氯苯酚的超高效液相色谱-串联质谱和气相色谱分析方法，对其在百合植株中的残留降解动态进行分析，以期为咪鲜胺在百合中的安全合理使用准则以及安全性评价提供科学依据.
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Aglien LC1290液相系统配备ABSCIEX 4500Q质谱，购于美国Aglien和SCIEX公司；气相色谱仪7890A，购于美国Aglien公司；电子天平CPA225D，购于德国赛多利斯股份公司；高速离心机Centrifuge 5424，购于Eppendorf艾本德公司；低速台式离心机TDL-40B，购于上海安亭科学仪器厂；微量移液器，购于Eppendorf艾本德公司；多管涡旋混匀仪，购于杭州瑞诚仪器有限公司.
试验样品名称：45%咪鲜胺微乳剂，购于深圳诺普信作物科学股份有限公司；咪鲜胺，纯度99.4%，2，4，6-三氯苯酚，纯度99.6%，购于Dr.Ehrenstoifer；色谱级乙腈、甲醇、乙酸乙酯和甲酸，购于默克化工技术(上海)有限公司；分析级乙腈、乙酸乙酯、无水硫酸镁，购于国药集团化学试剂有限公司；净化剂C18、PSA、GCB，购于天津博纳艾杰尔科技有限公司.
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按照《农作物中农药残留试验准则》(NY/T 788-2018)[18]要求，设50 m2百合消解动态试验小区，另设相应对照小区，小区间留有保护行. 45%咪鲜胺微乳剂在防治百合叶枯病中的推荐剂量为506.25 g a.i/ha(制剂75g/667 m2). 施药方法为喷雾，施药时期为叶枯病发病初期，施药次数为1次. 施药后分别在2 h、1 d、2 d、3 d、5 d、7 d、14 d、21 d、28 d时采集百合植株样品，设3个重复，另设空白对照. 田间试验分别在湖南省娄底市双峰县甘棠镇(露地)和山东省德州市齐河县祝阿镇(露地)进行.
百合植株样本的采集与制备：分别在对照小区和处理小区内随机剪取不少于12株生长正常、无病害的百合植株地面部分(样品量不少于2 kg)，去掉明显腐坏和萎蔫的茎叶，切成长约1 cm的小段样品，混匀后用四分法分别取200 g的样品两份，装入样品袋中，贴好标签，贮存于-20 ℃冰箱中冷冻保存.
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咪鲜胺：称取均质后百合植株样品10 g(精确到0.01 g)于100 mL离心管中，加入20 mL乙腈(含0.1%乙酸)，多管涡旋振荡器振荡提取10 min，摇匀，4 000 r/min离心5 min. 取1 mL上清液于装有50 mg C18、10 mg GCB和150 mg硫酸镁的微量离心管中，剧烈振摇1 min，在12 000 r/min离心4 min，上清液过0.2 μm滤膜后液质联用仪待测.
2，4，6-三氯苯酚：称取均质后的百合植株样品10 g(精确到0.01 g)于100 mL离心管中，加入20 mL乙腈(含0.1%乙酸)，多管涡旋振荡器振荡提取10 min，摇匀，4 000 r/min离心5 min. 取2 mL上清液用旋转蒸发仪40 ℃水浴蒸干，然后用丙酮复溶，定容至1 mL后置于装有50 mg C18、10 mg GCB和150 mg硫酸镁的微量离心管中，剧烈振摇1 min，12 000 r/min离心4 min，上清液过0.2 μm滤膜，最后使用气相色谱仪检测.
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液相条件：色谱柱为ZORBAX Eclipse Plus C18(3 m×100 mm，1.8 μm)，柱温为35 ℃，流速为0.4 mL/min，进样量为1.0 μL，流动相为乙腈/0.1% 甲酸水(V/V) 溶液. 梯度洗脱：0~0.5 min，40%乙腈；0.6~2.9 min，90%乙腈；3.0~4.0 min，40%乙腈. 质谱条件：离子源类型为ESI+，离子源温度为500 ℃，离子喷雾电压为5 500 V，气帘气压力为40 psi，喷雾气压力为45 psi，辅助加热气压力为45 psi，咪鲜胺质谱测定参数见表 1.
气相色谱条件：色谱柱为HP-5(30 m×320 μm，0.25 μm)，进样口温度为250 ℃，进样量为1.0μL，检测器温度为325 ℃，升温程序条件为首先从100 ℃以10 ℃/min升温至200 ℃，保持1 min，再以25 ℃/min升温至300 ℃，保持2 min.
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分别称取咪鲜胺和2，4，6-三氯苯酚标准物质，分别用乙腈和丙酮溶解，配制成1 000 mg/L的母液. 再用乙腈和丙酮逐级稀释成质量浓度分别为1、0.5、0.1、0.05、0.01和0.005 mg/L的标准溶液.
空白百合样品经过上述提取及净化过程，得到基质空白溶液. 移取1 mL空白基质溶液于进样小瓶中，用氮气吹至近干，用溶剂标溶解并定容至1 mL. 按此方法分别配制咪鲜胺和2，4，6-三氯苯酚百合植株系列空白基质标准溶液.
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称取10 g百合植株样品于100 mL离心管中，分别添加0.01、0.1和0.5 mg/L的咪鲜胺和2，4，6-三氯苯酚的标准溶液，静置3 h后按上述条件进行前处理及检测. 每个处理重复5次，计算添加平均回收率及相对标准偏差.
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采用一级动力学方程计算咪鲜胺在百合植株中的残留量变化：
其中：C0为施药后咪鲜胺在百合植株中的拟合原始沉积量(mg/kg)，T为施药后时间(d)，CT为施药后时间T时百合植株中咪鲜胺的残留量(mg/kg)，k为百合植株中咪鲜胺的消解系数，T1/2为咪鲜胺在百合植株中的消解半衰期(d).
基质效应计算植株提取物对咪鲜胺在质谱中响应值的影响：
其中：Km和Ks分别为基质标准曲线和溶剂标准曲线的斜率.
1.1. 仪器与试剂
1.2. 田间试验
1.3. 分析方法
1.3.1. 样品前处理
1.3.2. 仪器条件
1.3.3. 标准溶液的配制
1.3.4. 添加回收试验
1.4. 数据处理
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以标准溶液浓度为自变量x，以峰面积为应变量y进行回归拟合. 结果表明，添加量为0.005~1 mg/kg时，咪鲜胺和2，4，6-三氯苯酚的溶剂标和基质标均具有良好的线性关系(R2 ≥ 0.99)(见表 2). 添加量为0.01~0.5 mg/kg时，咪鲜胺在百合植株中的平均回收率为80.2%~87.8%，RSD为5.2~6.7%；2，4，6-三氯苯酚在百合植株中的平均回收率为81.1%~105.5%，RSD为3.0%~8.4%(见表 3).
结果表明，本试验所建立方法的准确性和重现性均能满足农药残留分析要求.
咪鲜胺和2，4，6-三氯苯酚检测方法的检出限(LOD)分别为0.001 mg/kg和0.005 mg/kg，最低检测浓度(LOQ) 均为0.01 mg/kg.
植物中的代谢产物在农药残留检测中会对质谱检测产生干扰而影响分析结果的准确性与精密度，因此在残留分析中应考虑不同作物所带来的基质效应[16]. 结果表明：百合植株提取液对咪鲜胺的基质效应分别为60.0%，属于强基质效应，植株样本检测均采用基质标准曲线进行校正计算(表 2).
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使用45%咪鲜胺微乳剂对百合喷雾施药，百合植株中咪鲜胺的残留量随着时间的推移而逐渐降低，且消解动态符合一级动力学方程. 湖南点消解动态方程为CT =3.495 5e-2.71，R2=0.901 8，半衰期为0.3 d，山东点消解动态方程为CT =7.909 6e-1.86，R2 = 0.913 5，半衰期为0.4 d；消解动态结果表明，咪鲜胺在百合植株中降解迅速，属于易降解农药，施药后28 d时，咪鲜胺在百合植株中的残留量仅为0.002 mg/kg和0.097 mg/kg. 代谢物2，4，6-三氯苯酚表现为积累和消解两个阶段，呈先上升后下降的变化规律，代谢物2，4，6-三氯苯酚残留水平在施药后第3 d达到最高，而后逐渐消解. 说明咪鲜胺施用在百合上后很快降解成了2，4，6-三氯苯酚，随后主要以2，4，6-三氯苯酚形式在百合植株体内存在.
2.1. 分析方法的线性关系、准确度和精密度
2.2. 咪鲜胺在百合中的消解动态
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农作物种植过程中使用农药有助于农业生产，预防和控制病虫草害. 咪鲜胺作为一种广谱性杀菌剂，在水果和蔬菜中应用广泛. 但长期不合理使用会导致农药残留量超标，进而降低农产品的质量. 蔬菜中咪鲜胺残留量常规检测方法需用丙酮盐酸提取，在240 ℃条件下与盐酸吡啶盐反应，将样品中的咪鲜胺分解为2，4，6-三氯苯酚后，通过气相色谱检测总的2，4，6-三氯苯酚含量，最后得到咪鲜胺残留量. 该方法过程复杂，操作难度大，且不能同时检测咪鲜胺和2，4，6-三氯苯酚[13, 16]. 本研究建立了乙腈提取和分散固相萃取净化，结合超高效液相色谱-串联质谱法和气相色谱法，同时测定百合植株中咪鲜胺及其代谢物2，4，6-三氯苯酚残留的分析方法，该方法简单快速，准确度和精密度均符合农药残留试验准则的相关要求.
本研究发现咪鲜胺在百合植株中降解迅速，半衰期不到1 d，而其代谢物2，4，6-三氯苯酚则表现为积累和消解两个阶段，呈先上升后下降的变化趋势. 说明咪鲜胺施用在百合上后很快降解成了2，4，6-三氯苯酚，随后主要以2，4，6-三氯苯酚形式在百合植株体内存在. 这一研究结果与前人关于咪鲜胺在蔬菜和水果上的残留行为一致. 而另有研究发现，咪鲜胺在不同土壤环境中的残留消解速度也较快，水稻土壤中的消解半衰期为4.72 d[20]，人参土壤中为8.39 d[21]，小麦土壤中为2.83~8.76 d[22].
综上所述，咪鲜胺在百合植株中的消解动态结果表明，咪鲜胺在百合植株中降解速度快、残留低，属于容易降解的农药. 但施用后咪鲜胺很快转化为毒性更强的环境污染物2，4，6-三氯苯酚，这为咪鲜胺在百合上的安全使用提供了警示与参考. 目前我国尚未对咪鲜胺在百合病虫害防治中的使用进行登记，也尚未制定咪鲜胺在百合上的最大残留限量，建议加强特色经济作物百合上的农药登记和MRL制定工作，保障群众食品质量安全.
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