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柑橘木虱(Diaphorina citri Kuwayama)是危害芸香科(Rutaceae)植物的害虫，为柑橘黄龙病的传播媒介之一，柑橘黄龙病被称为柑橘产业的“癌症”[1]. 柑橘木虱危害严重时，柑橘新梢枯死，其排泄物还可引发煤烟病. 柑橘木虱成虫和若虫均可携带病原菌，在吸食感染黄龙病的柑橘树后的5周内，若虫感染率可达60%~100%，成虫感染率达40%. 感染了黄龙病菌的柑橘木虱，可终身携带黄龙病菌[2-3]，并在体内持续繁殖. 因此，控制柑橘木虱对于遏制黄龙病的传播具有至关重要的作用.
目前，柑橘木虱应急防控主要采用化学防治，有效的杀虫剂包括有机磷类、有机氯类、新烟碱类、氨基甲酸酯类等[4]. 然而，过度或不合理使用药剂会使柑橘木虱产生抗药性，并引发环境污染等问题. 因此，寻找高效绿色的防控技术对于果园柑橘木虱和黄龙病的防控尤为重要. 植物叶片、花朵、果实等释放的具有挥发性质的化合物在害虫防治中发挥了重要作用，柑橘木虱的非寄主植物漆树科腰果属被子灌木腰果(Anacardium occidentale)中的有效成分(E)-4，8-二甲基壬-1，3，7-三烯和(3E，7E)-4，8，12-三甲基十三烯-1，3，7，11-四烯被证实对柑橘木虱具有驱避作用[5]；柑橘木虱侵害一个月后，嫁接枳橘的柑橘树挥发物质萜烯醇含量显著增加，增加了对柑橘木虱的驱避效果[6]. 植物挥发物在抗虫研究中具有广阔的应用前景，这些研究将为柑橘木虱防治提供了新思路[7].
互叶白千层(Melaleuca alternifolia Cheel)属于桃金娘科(Myrtaceae)植物，是一种产自澳大利亚东部的常绿灌木，20世纪初引入中国，目前广泛种植于广西、广东、四川、江西、福建等地. 互叶白千层有2种生态类型，即1，8-桉叶素型和4-松油醇型，这2种生态类型之间的单萜对映体如α-蒎烯、4-松油醇和α-松油醇的分布存在显著差异[8]. 互叶白千层的新鲜枝叶通过蒸馏可得到具有豆蔻气味的无色或浅黄色透明油状液体，亦称茶树精油，该精油具有低毒、不污染粮食和环境、害虫不易产生抗性等特点，具有广谱抗菌、防霉、杀虫等活性[9]，可干扰灰霉菌(Botrytis cinerea)的生长过程并导致其死亡[10]，与其他精油协同作用可增强对李斯特菌(Listeria monocytogenes)的抑菌强度[11]，对杂拟谷盗(Tribolium confusum)及玉米象(Sitophilus zeamais)的驱避、灭杀和熏蒸效果明显[12].
在对柑橘病虫害危害情况进行田间调查时，发现互叶白千层已作为隔离防护带种植于柑橘园区，以防控害虫. 植物挥发性物质是植物与昆虫之间重要的信息化学物质，在昆虫对寄主的搜寻过程中，寄主植物所散发的化学信号起到重要作用，昆虫依靠植株释放的挥发性物质来区分是否为寄主植物[13-14]. 柑橘木虱是寡食性昆虫，寄主范围仅限于芸香科50多种植物[15]，桃金娘科植物互叶白千层及其主要成分对柑橘木虱的行为有何影响，可否用于柑橘园柑橘木虱的防控，值得进一步探索. 本研究利用Y型嗅觉仪法联合气质联用技术GC-MS、触角电位仪EAG等方法测试分析了互叶白千层及其主要挥发物对柑橘木虱的行为反应，调查了互叶白千层作防护林的柑橘园中的柑橘木虱和黄龙病的发生情况，以明确互叶白千层对柑橘木虱的趋性反应和田间应用效果，为开发柑橘木虱绿色防控技术提供了理论依据.
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柑橘木虱采自仲恺农业工程学院海珠校区校园内的九里香植株. 互叶白千层株高15 m，采自广东肇庆柑橘园区周边，每隔2棵依次采集枝叶，并收集于标记为1，2，3，4的采样袋中.
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使用仪器包括：美国安捷伦科技有限公司的7890A-5975C气相色谱-质谱仪、7890B-GC-EAG联用触角电位仪，南京雪莱生物科技有限公司的Y型嗅觉仪、流量计，杭州葫陆实业有限公司的纯露机蒸馏器.
供试试剂包括：上海迈瑞尔生化科技有限公司的4-油醇(CAS：562-74-3)(纯度≥98%)、γ-松油烯(CAS：99-85-4)(纯度≥95%)和1，8-桉叶素(CAS：470-82-6)(纯度≥99%)，广州东巨实验仪器有限公司的液体石蜡，南京诺唯赞生物科技股份有限公司的植物DNA提取试剂盒及DNA凝胶回收试剂盒，北京全式金生物技术股份有限公司的克隆PCR产物专用载体.
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利用Y型嗅觉仪进行测定，该仪器由真空抽气泵、活性炭过滤瓶、蒸馏水过滤瓶、流量仪、气味瓶、Y型管组成. 试验过程参照张旭颖[16]研究中的方法并做改良. 为确保木虱释放后向上移动并对味源做出选择，将Y型管斜放45°并固定于白色纸板上，进虫管用黑色胶带覆盖至分岔口之间，连接完成后将其置入养虫笼内，打开养虫笼顶部的白炽灯作为光源，虫笼上覆盖黑布以消除光源干扰. 测试在室内完成，测试时间为12：00~17：00，室内温度控制在(26±1)℃，相对湿度为(65±5)%.
用眼科剪剪枝叶2~3 cm，称取8 g枝叶置放于味源瓶中，处理区为8 g剪碎的互叶白千层枝叶，对照区为空气. 每次测试1头成虫，每测试10头后更换新鲜枝叶和Y型管并更换味源瓶位置，消除位置因素的影响. 每头成虫测试15 min，气体流速控制为200 mL/min. 当虫体爬过味源臂1/3处30 s以上时视为对该气味源作出反应. 每次开始测试前，先给Y型管通气15 min，使气味充满整个Y型管后开始测试. 随机测试200余头成虫，待虫体作出选择后，在体视镜下将雌雄成虫分开，分别置于20 cm的指型管内并计数. 若柑橘木虱在设定时间内一直停留在释放臂未作出选择则不计其数量，继续引入柑橘木虱，直至虫体作出选择为止. 每10头1组测试后，更换洁净的Y型管及气味源瓶. 测试结束后用75%乙醇溶液清洗气味瓶和Y型管，晾干供下次使用.
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采用HOOLOO灵犀电热纯露机蒸馏器提取精油. 该蒸馏器根据蒸馏的原理，利用液体加热后沸点的差异，将液体分离成不同的组分，从而将植物中的精油提取出来. 使用时，首先将植物放入蒸馏器中，根据料液比加入适量水，而后加热沸腾，产生蒸汽. 蒸气经过冷凝器冷却后成为液体，即可得到精油. 物料罐每次加入长2~3 cm枝叶，共206.5 g，料液比为1∶4(206.5 g物料，826 mL水)，蒸馏92 min (加热时长为32 min，32 min后出露)，待蒸馏结束后收集精油，并计算精油得率.
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样品前处理：将精油样品用乙酸乙酯稀释200倍，待测.
GC条件：色谱柱为石英毛细管柱DB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；载气为高纯氦气(99.999 5%)；分流比1∶5；流速为1.2 mL/min，程序升温为50 ℃保持3 min，以5 ℃/min升至160 ℃，再以10 ℃/min升至280 ℃，保持5 min；进样口温度为260 ℃；进样量为1 μL.
MS条件：EI源，电离电压70 eV；离子源温度为230 ℃；四极杆温度为150 ℃；传输线温度为280 ℃；扫描范围40~550 amu，全扫描方式.
数据处理：利用安捷伦化学工作站定性软件和NIST14数据库鉴定化合物.
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采用GC-EAG联用触角电位仪分别测定柑橘木虱雌、雄成虫对互叶白千层精油的反应. 每头成虫只测1根触角，每测1次后更换不同的成虫，更换触角时，用酒精清洗电极针，晾干后重复使用. 雌、雄成虫各重复测试6次.
试验测定步骤如下：打开触角电位仪和气相色谱仪开关，打开空气、氢气、氮气瓶开关旋钮，对仪器进行预热. 开启软件Gc-Ead 2014 v1.2.5准备记录，打开软件7890B-GC，设置进样口温度260 ℃，载气为流速1 mL/min的99.999% N2，分流比1∶5，充分预热后设定升温程序，50 ℃保持3 min，以5 ℃/min的速率升至160 ℃，再以10 ℃/min升至280 ℃，保持5 min；进样量为1 μL. 用丙酮稀释互叶白千层精油，经GC-EAG联用触角电位仪反复测试浓度范围. 精油浓度为2 μL/mL时，FID EVE化学物质图谱内化合物峰值未出现平峰，证明该浓度为合适浓度. 在体视显微镜下用昆虫解剖针及镊子将整个柑橘木虱头部分离，用导电胶将触角沾在电极两端，将连接好的触角固定在支架上，旋扭可移动支架的操作手柄把接好的触角电极推进到电位仪接口. 打开触角电位仪的Syn-tech IDAC-2检测器，当观察到软件图谱基线呈平缓后进行测定.
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柑橘木虱对互叶白千层精油及化学单体标准品的趋性反应参照1.3.1进行.
将滤纸剪成2.5 cm×2.5 cm大小并置于味源瓶内，每次测试时向滤纸片上加入10 μL待测液，处理区均为待测试剂，对照区均为10 μL液体石蜡. 打开气泵，将气体流速控制为200 mL/min，每次开始测试前，先向Y型管内通气15 min，使气味充满整个Y型管之后再开始测试. 精油及每个单体标准化合物每个浓度测试80头成虫(每次1头). 每测试10头后更换味源瓶位置，以消除位置因素带来的影响. 若柑橘木虱在设定时间内一直停留在释放臂未作出选择则不计其数量，继续引入木虱，直到木虱作出选择为止. 每组测试结束后用75%的乙醇溶液清洗气味瓶和Y型管，放置室内晾干供用.
购买主要成分为4-松油醇、γ-松油烯、1，8-桉叶素的4-松油醇型互叶白千层. 精油及化学标准单体用液体石蜡稀释成3个浓度，互叶白千层精油稀释为20 μL/mL、30 μL/mL、60 μL/mL 3个浓度，4-松油醇稀释为5 μL/mL、10 μL/mL、100 μL/mL 3个浓度；γ-松油烯稀释为0.1 μL/mL、20 μL/mL、100 μL/mL 3个浓度；1-8-桉叶素稀释为0.1 μL/mL、2 μL/mL、10 μL/mL 3个浓度.
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2023年11月上旬，调查广东省德庆市互叶白千层作为隔离防护林的柑橘园中柑橘病虫害的发生情况. 调查时天气晴朗，温度约20 ℃. 柑橘园约23.33 hm2，四周有丘陵，果园位于一峡区内. 处理区密植互叶白千层作为防护层，株高约4 m，对照区未种植互叶白千层. 每0.07 hm2为一个调查小区，对照5个小区，处理5个小区. 每小区与果园边界间隔2~5行. 选取东、南、西、北、中5个点，每点选相邻植株2株，每株调查按东、南、西、北4个方向取新梢和嫩梢各2根，记录柑橘病虫害发生情况，计算带虫株率及每株平均虫量. 同时，调查每个小区中疑似黄龙病植株，按每株采集8~12片老熟黄化叶片作为一个样品，处理区为25个样品，对照区为25个样品，并带回实验室，按照刘顺民等[17]研究中的方法进行黄龙病菌的检测，引物为：OI1：5'- GCGCGTATCCAATACGAGCGGCA -3'，OI2C：5'-GCCTCGCGACTTCGCAACCCAT-3'，以黄龙病阳性样品的DNA为阳性对照、柑橘无病毒苗木样品为阴性对照，以ddH2O为空白对照，通过常规PCR技术进行检测，确认田间疑似黄龙病植株是否为黄龙病植株，计算柑橘黄龙病发生率.
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采用SPSS 26.0软件进行数据分析，对柑橘木虱的趋性数据进行x2适合性检验，田间调查数据进行新复极差法分析.
1.1. 供试昆虫与植物
1.2. 仪器及供试试剂
1.3. 试验方法
1.3.1. 柑橘木虱对互叶白千层枝叶的趋性反应
1.3.2. 互叶白千层精油提取及其成分分析
1.3.2.1. 互叶白千层精油提取
1.3.2.2. 互叶白千层精油成分分析
1.3.3. GC-EAG联用测定柑橘木虱对互叶白千层精油的行为反应
1.3.4. 柑橘木虱对互叶白千层精油及化学单体标准品的趋性反应
1.4. 互叶白千层对柑橘病虫害的田间防控效果
1.5. 数据处理与统计学分析
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柑橘木虱成虫对互叶白千层枝叶的趋性反应见图 1. 结果表明，柑橘木虱雌、雄成虫对8 g剪碎的互叶白千层枝叶表现出明显的负趋性(p＜0.01)，互叶白千层枝叶对柑橘木虱成虫具有明显的驱避作用.
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采用灵犀电热纯露机蒸馏器提取互叶白千层枝叶精油共26次，枝叶总质量为5 369 g，精油总质量为87 g，得油率1.6%. 根据互叶白千层精油密度0.878 g/mL(25 ℃)和公式V=m/ρ，计算得出提取约99 mL互叶白千层精油，与实际测量值吻合.
互叶白千层精油GC-MS分析得出的主要化合物及相对质量分数见表 1. 结果表明，4个采集袋中的枝叶精油共鉴定出29种化合物. 互叶白千层精油化学成分主要为萜类化合物，其中4-松油醇的平均质量分数为56.891%，γ-松油烯平均质量分数为17.005%，α-松油烯的平均质量分数为7.050%，对伞花烯的平均质量分数为5.250%，α-松油醇平均质量分数为4.027%，这5种成分占总质量分数的90.223%，且4-松油醇组分质量分数＞30%，根据国家标准[18]确定广东省德庆市柑橘园采集的互叶白千层的生态类型为4-松油醇型.
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柑橘木虱雌成虫、雄成虫对互叶白千层精油挥发性化学物质的GC-EAD反应图谱如图 2所示. 由试验结果可知，保留时间分别为11.504 min和15.200 min的精油成分均能引起柑橘木虱雌成虫、雄成虫触角产生电生理反应，相较于雄成虫，雌成虫在保留时间为10.159 min时也产生了电生理反应. 由GC-MS结果可知，保留时间为10.159 min对应的化合物为α-松油烯、11.504 min对应的化合物为γ-松油烯，15.200 min对应的化合物为4-松油醇，说明柑橘木虱雌成虫、雄成虫对γ-松油烯和4-松油醇均能产生行为反应，雌性除了对以上2种成分产生行为反应外，还对α-松油烯产生电生理反应. 4-松油醇和γ-松油烯这2种化合物对柑橘木虱雌成虫、雄成虫产生驱避或者吸引作用，尚需进一步进行验证.
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柑橘木虱对精油及其单体标准化合物的趋性反应见图 3. 行为反应测试结果表明柑橘木虱成虫对20 μL/mL、30 μL/mL互叶白千层精油(图 3A)以及0.1 μL/mL γ-松油烯(图 3B)均具有明显驱避作用，而对100 μL/mL 4-松油醇具有明显引诱作用(图 3C)，1，8-桉叶素3个浓度下对柑橘木虱成虫趋性反应无明显效果(图 3D).
柑橘木虱对20 μL/mL互叶白千层精油有极明显的负趋性(p＜0.001)，对30 μL/mL互叶白千层精油则表现出明显的负趋性(p＜0.05)，而对60 μL/mL该精油无明显趋性反应，表明互叶白千层精油在一定浓度范围内，才会对柑橘木虱成虫具有驱避作用. 柑橘木虱成虫对100 μL/mL 4-松油醇有明显负趋性(p＜0.05)，而对5 μL/mL和10 μL/mL 4-松油醇无明显趋性反应，说明100 μL/mL 4-松油醇对柑橘木虱成虫有明显驱避作用. γ-松油烯则与以上2种化合物不同，柑橘木虱成虫对0.1 μL/mL γ-松油烯有明显的正趋性(p＜0.05)，而对20 μL/mL和100 μL/mL γ-松油烯均无明显的趋性反应，表明0.1 μL/mL γ-松油烯对柑橘木虱有明显吸引作用. 1，8-桉叶素0.1 μL/mL、2 μL/mL和10 μL/mL这3个浓度对柑橘木虱的选择行为差异均无统计学意义，结果表明了在该浓度范围内，1，8-桉叶素对柑橘木虱行为反应无明显影响.
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田间调查结果表明，无论是否种植互叶白千层作为防护隔离带，柑橘种植区都有柑橘红蜘蛛、柑橘潜叶蛾、柑橘炭疽病的发生. 由调查结果可知，5个处理区的柑橘木虱成虫和若虫的数量均为0，而5个对照区均发现柑橘木虱，最高数量可达(14.0±2.7)头，有虫株率则为80%. 由此可见，互叶白千层在柑橘果园中对柑橘木虱驱避效果明显，能有效阻止柑橘木虱危害(表 2).
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由PCR检测结果可知，处理区25个样品与阴性对照、ddH2O空白对照结果相同，均无明显条带；对照区中25个样品共6个样品扩增出或明或暗的目的条带，条带大小约为1 100 bp. 对扩增产物纯化回收与克隆转化，挑选出阳性克隆子，将阳性克隆子送至广州天一辉远基因科技有限公司测序分析，而后将所得序列在NCBI中与基因库所有序列进行比对分析，所得序列均为亚洲柑橘木虱黄龙病菌，相似度均为100%. 本次在广东德庆市柑橘园处理区25个样品均未检测出黄龙病菌，而对照区共检测出6个样品携带黄龙病菌，阳性率为24%(表 3)，说明处理区内密植的互叶白千层防护林可以有效阻隔柑橘木虱为害，减少对目标区域柑橘树的侵害，遏止了柑橘黄龙病的传播.
2.1. 柑橘木虱对互叶白千层枝叶的趋性反应
2.2. 互叶白千层精油的得油率及其成分分析
2.3. GC-EAG联用测定柑橘木虱对互叶白千层精油的行为反应
2.4. 柑橘木虱对互叶白千层精油及其单体标准化合物的趋性反应
2.5. 互叶白千层对柑橘木虱的田间防控效果
2.6. 田间柑橘黄龙病PCR检测结果
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柑橘黄龙病是毁灭性病害，目前已成为柑橘产业的发展瓶颈，柑橘木虱是田间传播柑橘黄龙病的媒介昆虫，如何有效防控柑橘木虱成为防控柑橘黄龙病的有效措施之一. 从农田生态系统整体功能出发的生态调控是目前最安全、有效和可持续的害虫管理措施之一，其核心是基于“作物—害虫—天敌及其周围环境”的相互作用关系，构建合理的生态技术体系，以调控、保护和利用农田生物多样性；这种方法的目标是促进天敌的繁殖和作物的生长，同时不利于害虫的发展，以充分发挥农田生态系统在控制害虫方面的生态服务功能[19]. 田间调查结果表明，广东省德庆市柑橘种植区引入4-松油醇型互叶白千层作为隔离防护带，可以有效阻隔柑橘木虱危害和柑橘黄龙病的发生，为田间栽培4-松油醇型互叶白千层防控柑橘木虱提供了理论基础，为探索柑橘木虱绿色防控技术做了大胆尝试，对防控柑橘黄龙病具有重要意义.
互叶白千层主要有3种生态类型，即1，8-桉叶素型、γ-松油烯和4-松油醇型. 不同地理、生态类型和提取方法对互叶白千层精油的主要特征组分和次要含量都有影响. 4-松油醇型也是衡量互叶白千层品种的重要指标之一，质量分数越高代表品种越优良[20]. 互叶白千层精油具有特殊气味，影响昆虫的选择行为，对害虫具有良好的生物活性[21]. 目前，在害虫防控方面主要集中在4-松油醇上，4-松油醇能阻止葱蝇(Delia antique)在其寄主上产卵[22]，但4-松油醇对不同害虫可能显示出不同的行为反应，如4-松油醇对北美天牛(Hylotrupes bajulus)有强烈的引诱作用[23]，聚乙烯管中涂抹4-松油醇可致使小蠹虫(Rtyogenes chalcagphus)在群集或扩散等习性中迷失方向[24]，黄衫大痣小蜂(Megastigmussp)雌性还对4-松油醇产生强烈的正趋性[25]，4-松油醇与其他化合物混合可作为引诱剂对大露尾甲(Rhizophagus grandis)进行捕捉[26]. 云杉树特征主分中含有互叶白千层精油的共有成分4-松油醇，当树皮甲虫危害云杉树时，该树会释放出4-松油醇等物质，对雄性甲虫起到了驱避作用[27]. 本研究结合气相色谱-质谱联用仪GC-MS测定了广东省德庆市柑橘园种植的互叶白千层的主要成分及含量，确定其生态类型为4-松油醇型，柑橘木虱雌、雄成虫对互叶白千层及其主要成分4-松油醇和γ-松油烯均能产生行为反应，柑橘木虱对100 μL/mL 4-松油醇有明显驱避作用，对0.1 μL/mL γ-松油烯有明显吸引作用，而对1，8-桉叶素没有明显的行为反应. 嗅觉行为测定结果表明柑橘木虱对4-松油醇型互叶白千层枝叶表现出明显的驱避作用，20 μL/mL和30 μL/mL 4-松油醇互叶白千层精油对柑橘木虱成虫也有明显的驱避作用. 互叶白千层精油具有广谱抗菌、防霉、杀虫等活性，可进一步研究该植物及其精油对其他作物有害生物的行为影响，明确互叶白千层在有害生物绿色防控中的防虫防菌谱，开发互叶白千层的生产应用价值.
当前柑橘木虱的绿色防控是一种极具前景的防治方向，广西特色作物研究院研究团队已进行多次试验，采用50目防虫网搭建密闭型网棚(棚肩高3 m，拱高1.25 m，总高4.25 m)，在网棚内种植柑橘树有效控制了柑橘木虱的数量和黄龙病病菌的传播[28]. 本研究表明，密植株高约4 m的4-松油醇型互叶白千层作为隔离防护带因其高大的树体结构所形成的屏障及其对柑橘木虱的驱避作用也可应用于柑橘园防控柑橘木虱，减少农药使用和病虫害防治成本，可进一步在适宜栽种互叶白千层的地区推广应用.
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