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新型冠状病毒感染肺炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)，以下简称新冠肺炎. 新型冠状病毒(SARS-CoV-2)从首次被鉴别出至今已逾1年，因其具有较高的传染性，持续对我国及全世界人民的生活产生不利影响. 新冠肺炎患者初期以发热、干咳、乏力为主要症状，部分患者可伴有纳差、腹泻等消化道症状或恶寒、肌痛，少数可能无发热症状；随病情进一步发展，中期及重症期可出现口咽舌干、胸闷、呼吸困难、多脏器功能衰竭等表现[1-2]. 从既往的病毒感染治疗策略来讲，直接的病毒抑制是有效的方法之一，遗憾的是目前尚无针对新型冠状病毒的特效抑制药[3]. 从抗击疫情的临床实践来讲，中药的应用发挥着重要积极的作用[3].
应用中药，关键在于以中医药理论为支撑. 新型冠状病毒是新冠肺炎的致病因子，热是新冠肺炎的重要病机之一[4]. 针对病机的辨证施治是现阶段中医药治疗新冠肺炎的主要手段，即统筹兼顾清热的治法是一种重要的手段. 青蒿(菊科植物黄花蒿的干燥地上部分Artemisia annua L.)，为常用寒性清热中药，具有清虚热、除骨蒸、解暑热、截疟、退黄的功效，临床应用无毒性发生. 推测青蒿具有应用于新冠肺炎的可行性. 通过文献分析，青蒿成分较多，存在多靶点的可能，故引入网络药理学方法进行快速分析[5]，以便促进新冠肺炎的更好防控.
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中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)，人类基因组注释数据库(GeneCards)，有机小分子生物活性数据库(Pubchem)，蛋白相互作用数据库STRING 11.0，UniProt数据库，Cytoscape 3.6.1软件，Omicshare云平台.
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采用TCMSP数据库，在“Herb name”项下，以“青蒿”为检索词，获取青蒿已知的化学成分，筛选出具有良好口服生物利用度(OB≥30%)和类药性(DL≥0.18)的化合物[5]. 根据筛选出的化合物，采用TCMSP数据库和Pubchem数据库进行靶点预测. 将靶点预测结果导入UniProt数据库进行基因的标准化处理，并导入STRING 11.0映射为人的基因.
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以“Corona Virus Disease 2019”为检索词，在GeneCards数据库中获取新冠肺炎的相关靶点，筛选得分为10.00以上的靶点，得到目前治疗新冠肺炎的相关靶点.
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将1.2得到的青蒿活性成分及靶点与新冠肺炎相关靶点于Omicshare云平台取交集，所得交集靶点即为青蒿作用于新冠肺炎的预测靶点. 构建“药物—活性成分—疾病—靶点”网络图，利用Cytoscape 3.6.1软件中的“Network Analyzer”功能对青蒿化学成分—作用靶点网络进行分析. 节点(node)代表青蒿及其活性成分、疾病、靶点；边(edge)展现青蒿与活性成分、活性成分与疾病、疾病与靶点之间的联系.
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为进一步研究青蒿干预新冠肺炎的作用机制，将1.4交集得到的靶点导入STRING 11.0进行蛋白质与蛋白质相互作用(PPI)分析，将种属设置为“Homo sapiens”，最低相互作用评分设置为0.400，网络边含义设置为“molecular action”，其余参数保持默认设置，得到青蒿作用于新冠肺炎的PPI网络. 借助Cytoscape 3.6.1软件中的“Network Analyzer”功能对PPI网络进行拓扑分析，选取自由度(Degree)大于平均值的靶点为关键靶点[6].
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将1.5筛选出的关键靶点运用STRING 11.0 “Analysis”功能，进行基因功能(gene ontology，GO)分析和基于京都基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析[7].
1.1. 数据库与软件
1.2. 青蒿的活性成分及靶点获取
1.3. 新冠肺炎相关靶点获取
1.4. 青蒿—活性成分—疾病靶点网络的构建与分析
1.5. PPI网络的构建及关键靶点筛选
1.6. GO功能分析和KEGG通路富集分析
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在TCMSP中获得216个化合物，设定OB≥30%，DL≥0.18，得到化合物22个，逐一对应发现3个化合物无对应靶点，分别是青蒿烯(artemisitene)、维采宁-2(vicenin-2_qt)、双氢青蒿素(dihydroartemisinin). 采用Pubchem数据库对TCMSP未预测出靶点的3个化合物进行预测，仍未获得靶点信息，故青蒿活性成分为19个(表 1)，对应182个靶点.
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从GeneCards数据库中检索到新冠肺炎相关靶点60个，设定分值(S≥10.00)后，得到41个靶点.
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将182个化合物靶点与41个新冠肺炎靶点取交集，得到13个交集基因(图 1)，对应青蒿中14个化合物. 利用Cytoscape 3.6.1软件构建青蒿—活性成分—疾病靶点相互作用网络，网络中有29个节点和114条边(图 2). 图 2中绿色填充为青蒿，紫色填充为活性成分，红色填充为靶点，黄色填充为新冠肺炎. 图中槲皮素、木犀草素、山奈酚等黄酮类化合物度值较高，靶点为NOS2的化合物有12个，分别为泽兰黄醇素、柽柳黄素、藤菊黄素、茵陈黄酮、艾黄素、蓟黄素、线蓟素、牡荆苷、甲氧基万寿菊素、芹菜素-6，8-C-二葡萄糖苷、异鼠李素和山奈酚.
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将13个交集基因通过STRING 11.0进行PPI网络分析(图 3)，可知网络所有靶点均可以发生蛋白相互作用，128条边代表了蛋白之间的相互作用. 网络中各节点的平均自由度为9.8，筛选后得到7个核心靶点(IL6，TNF，CCL2，IL1B，NOS2，TP53，CASP3)，见表 2.
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7个青蒿—新冠肺炎核心基因影响了266个生物学过程(p＜0.01，FDR＜0.01). 选取FDR值排名前20的功能信息(图 4)，结果显示核心基因主要富集在细胞对生物刺激的反应、细胞因子介导的信号通路、对脂多糖的反应、对生物刺激的反应等生物过程中.
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7个青蒿—新冠肺炎核心基因富集在59条通路上(p＜0.01，FDR＜0.01)，选取FDR值排名前20的通路(图 5)，其中与抗病毒密切相关的通路包括NOD样受体信号通路、肿瘤坏死因子(TNF)信号通路.
2.1. 青蒿活性成分及靶点的筛选结果
2.2. 新冠肺炎靶点获取结果
2.3. 青蒿—活性成分—疾病靶点网络的构建与分析
2.4. PPI网络的构建及关键靶点筛选结果
2.5. GO功能分析结果
2.6. KEGG通路富集分析结果
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新冠肺炎是新发的传染性疾病，对居民日常起居、睡眠和生活习惯均产生了不利影响[8]，甚至危及生命. 本文运用网络药理学的方法，系统分析青蒿干预新冠肺炎的机理. 首先通过查询数据库获取青蒿中的活性成分以及靶点信息，将获取的靶点信息与疾病的靶点信息取交集后构建“药物—成分—疾病”靶点网络图，从而识别核心靶点干预的基本生物学功能和疾病信号转导通路，进而揭示青蒿对新冠肺炎作用的可能机制[9].
通过对TCMSP数据库及Pubchem数据库的查询、分析得出，青蒿干预新冠肺炎的活性成分有14个，其中12个活性成分均可作用于NOS2. 活性成分中度值较高的黄酮类化合物已有研究报道，槲皮素、山奈酚、木犀草素与新冠肺炎推荐药的亲和力相似[10-11]. 槲皮素、山奈酚、木犀草素均为常见的中药化学成分，对它们的研究较早、较多，具有抗炎、抗氧化应激等作用[12-13]. 对新冠肺炎逝者解剖结果显示，巨噬细胞渗出性炎症是重要的病理表现[14]，表明槲皮素、山奈酚、木犀草素是干预新冠肺炎发病过程的有效成分，而靶点为NOS2的其他活性成分也是关注的重点.
NOS2是本研究的核心靶点之一，其在免疫、炎症、肿瘤、病毒感染等方面均能发挥作用[15]. 在流感病毒致死的基因组研究中，NOS2与存活率相关，其证据是患者死亡前24h内NOS2表达异常上调[16]. 针对巨病毒的研究亦认为，NOS2的缺乏是致死的重要原因[17]. 此外，缺氧可诱导NOS2高表达[18]. 新冠肺炎解剖提示肺通气—换气功能障碍[14]，表明NOS2与新冠肺炎密切相关.
TNF/NOS2是巨噬细胞在感染后启动固有免疫防御的重要信号通路[19]. 感染可激活固有免疫细胞，固有免疫分子发挥固有免疫防御是免疫学的共识. 新型冠状病毒感染激活的主要是巨噬细胞，巨噬细胞分泌TNF以抑制病毒复制，TNF的过表达促进TNF/NOS2信号通路启动，导致IL-6，IL1B等炎症因子过表达，IL过表达会加重炎症[20]，新冠肺炎临床研究也证实了这一点[21]. 核心靶点的GO功能富集分析印证了青蒿通过信号转导等生物过程干预新冠肺炎. 通过对KEGG通路分析，青蒿可作用于TNF/NOS2信号通路的多个靶点，认为青蒿可能通过TNF/NOS2信号通路减轻新冠肺炎的肺部炎性损伤.
综上所述，本文采用网络药理学的策略对青蒿中的活性成分、作用靶点及通路进行了快速分析，表明青蒿应用于新冠肺炎具有一定的可行性，揭示青蒿通过多成分、多靶点、多途径作用于新冠肺炎，主要的作用通路为TNF/NOS2信号通路.
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