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目前市场上的增香剂种类繁多,香豆素就是其中的一类,被广泛用于食品、化妆品等行业[1-2].而动物实验表明香豆素具有致癌性,是一种高毒性的内酯类化合物[3].毒理研究发现香豆素在人体的含量达到一定量时,会给肝脏带来一定的伤害[4],进而欧洲一些国家对香豆素的添加量做了规定[5-6].牛血清白蛋白(BSA)是一种单链结构蛋白质,既能与亲水性分子结合,也能和疏水性物质结合[7-8],加之在结构与性能上,BSA与人血清白蛋白有一定的相似性,把它放到模拟人体环境中研究生物效应机理具有一定的指导意义[9].
目前科研工作人员对香豆素的研究也做了大量的工作,杨树平等人[10]用荧光光谱法研究了不同温度下配合物与BSA的相互作用;陈爱菊[11]运用紫外-可见分光光度法(UV-vis)以及荧光光谱法等探讨了香豆素类抗癌药物与环糊精及BSA在水溶液中的相互作用;Shobini J团队[12]研究了合成香豆素与人血清白蛋白的相互作用;刘雪锋等人[13]利用运用荧光光谱(FS)、紫外光谱(UV)法研究了3种香豆素中药小分子与BSA的相互作用.这些方法虽然灵敏度高,重现性好,但存在背景干扰大、分析时间长、操作复杂等问题.本研究主要以银纳米粒子为基底,表面增强拉曼光谱(SERS)技术具有制样简单、分析时间短等优点,首次运用SERS技术考察香豆素与BSA的相互作用,以进一步从分子层面深入了解香豆素的药效机理.
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FS-100型傅立叶变换拉曼光谱仪(德国Bruker公司),Nd:YAG激光光源,液氮冷却Ge检测器;UV-2450紫外-可见分光光度计(岛津);S4800型扫描电子显微镜(SEM)(日本日立公司);80-1台式低速离心机(金坛科技仪器有限公司).根据Jingjing Ma’steam[14]的方法并稍加修改制备银纳米基底,0.5 mol/L的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)溶液作保护剂,乙二醇作为还原剂,乙二醇(C2H6OH)和PVP,统购于科龙化工试剂厂;根据方艳团队[15]的方法配制Tris-HCI(pH=7.40)缓冲溶液和BSA溶液,BSA购于如吉生物科技;三(羟甲基)氨基甲烷购于天津市科密欧化学试剂有限公司;称取0.05 g香豆素(C8H6O2)溶于无水乙醇,定容到500 mL容量瓶中配制成质量浓度为100 mg/L的香豆素标准溶液,保存备用.以上试剂均为分析纯.
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测定BSA和香豆素的常规拉曼光谱(NRS)与SERS,并对其峰进行归属;优化银纳米粒子与BSA的体积比,按体积比为4:1,3:1,2:1,1:1,1:2混合后进行拉曼测试;比较Ag和coumarin银纳米粒子为基底,香豆素溶液与Ag和BSA-coumarin银纳米粒子为基底,BSA与香豆素混合溶液混合的SERS.
1.1. 实验主要仪器与试剂
1.2. SERS检测
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由于在实验中PVP的使用浓度较高,为避免PVP对后续样品的SERS产生背景信号干扰,因此对PVP溶液进行背景拉曼测试,结果见图 1.从图 1中可以看出,PVP溶液本身并没有SERS背景信号,即在后续的SERS检测过程中,较高浓度的PVP并不会对实验的结果产生任何干扰.
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取少量制好的纳米银稀释后滴加到干净的硅片上,室温下干燥,在加速电压为20 kV的扫描电镜下进行扫描. 图 2是银纳米粒子的扫描电镜(SEM).从图 2中可以明显地看到,银纳米粒子的外形呈棒状,长短大小较为均匀,其粒径大小在80 nm左右[14].银纳米粒子表面能有效吸附目标分子,有较好的拉曼增强效果.
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通过紫外吸收光谱分别对Ag和coumarin与Ag和BSA-coumarin进行了表征(图 3),前者的吸收峰在478 nm左右,后者的吸收峰在468 nm左右,吸收峰略微蓝移.这是由于银纳米粒子的等离子体吸收峰与粒子的尺寸、形状和周围的介电常数有关,BSA是一个大的蛋白质,其吸附到银纳米粒子上,改变了它周围的介电环境,导致谱峰蓝移.
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图 4是BSA的NRS与SERS.从图 4中可以看出银纳米粒子对BSA有明显的增强效果.图中的曲线a是BSA的NRS,没有明显的特征峰出现,图中的曲线b是BSA与纳米银按照最佳体积比例1:3混合所测得的表面增强拉曼光谱,与曲线a相比,曲线b中出现了较多的峰,其中760 cm-1与1 461 cm-1这两个峰有明显的增强. BSA的SERS早有报道[16],760 cm-1归属于C—H面外变形振动,1 053 cm-1归属于C—N伸缩振动;1 461 cm-1归属于色氨酸残基环中O—C=O对称伸缩振动.
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图 5是银纳米粒子与BSA不同体积比例混合的表面增强拉曼光谱图.从图 5中可以看出,当Ag与BSA体积比为3:1时,BSA的拉曼信号最强.在位移为760,1 051,1 460 cm-1处有明显的增强,其760 cm-1处峰最为尖锐,在886 cm-1和930 cm-1左右有小峰出现,随着BSA的加入,可能对物质形成了比较厚的包裹层,拉曼响应明显变弱,因此选用体积比为3:1作为最佳混合比例.
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香豆素是一种内酯类化合物,结构见图 6.取一定量的香豆素溶液滴在玻片上,室温下自然晾干,图 7中曲线a是香豆素的NRS.图中曲线b是香豆素的SERS,从图中可以看出曲线a没有明显的峰,而对比NRS,香豆素的SERS峰的强度明显增加,参考《拉曼光谱手册》和《拉曼光谱在有机化学中的应用》这两本书,对香豆素的拉曼峰进行归属,其中348,374 cm-1处的C—C—C的扭曲振动;449,494,563,581,590 cm-1处的骨架变形振动;686,730,763 cm-1处的C—H面外弯曲振动,1 558,1 603 cm-1归属于C=C(芳烃)骨架伸缩振动的特征峰,由于苯环存在π电子共轭体系,可与银纳米粒子发生吸附,峰信号较强;817,865 cm-1处的—O—环呼吸不对称伸缩振动;936 cm-1处的—O—环呼吸对称伸缩振动;1 029 cm-1归属于C—O—C对称伸缩振动,增强效果明显;1 119,1 152,1 178,1 224 cm-1处的C—O不对称伸缩振动;1 277 cm-1处C—O—C伸缩振动,1 382,1 334,1 448 cm-1处的面内变形振动.
图 8为香豆素固体常规拉曼峰.与香豆素的SERS拉曼峰相比,可以发现峰的位置大致没有改变,只是有些峰发生了移动.其中523 cm-1处的骨架伸缩振动移到了581cm-1,峰型发生了改变;728 cm-1,761 cm-1的C—H面外变形振动移到了730 cm-1和763 cm-1;888 cm-1的峰分裂为817 cm-1和865 cm-1,1 399 cm-1的C—H面内变形振动移到了1 448 cm-1;1 702 cm-1拉曼峰在SERS中消失,这是因为香豆素中C=O与银纳米粒子发生了吸附;其他大多数出峰位置与香豆素的SERS一致.综上可知,以银纳米粒子为基底,香豆素的拉曼峰有明显的增强效果.实验对香豆素的拉曼位移进行了归属,香豆素的拉曼位移及归属见表 1.
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图 9为体积比为1:5,1:4,1:3,1:2,1:1的Ag和Coumain与Ag和BSA-Coumain的SERS.从图 9中可以看到拉曼峰的位置基本没有什么变化,香豆素的SERS信号在混合体积比为1:1和1:3时,682,968,1 485,1 725 cm-1处拉曼峰不稳定,说明香豆素直接吸附在银纳米粒子表面是不均匀的,当混合体积比为1:4时,拉曼峰的强度较好,表明两者混合比较充分,BSA能稳定吸附香豆素.而BSA与香豆素的复合物吸附在银纳米粒子上,SERS信号相对降低了,但峰的强度基本没有变化,这是由于BSA含有大量的侧链区域和立体的空间结构,能够均匀而稳定有序地吸附香豆素,使得SERS信号更加稳定.
图 10研究了与BSA作用后香豆素SERS的变化情况. 图 10中a为香豆素的SERS信号,b为Ag和BSA-Coumarin按照体积比为1:4的比例混合后复合物的SERS信号.从图中可以看出当加入牛血清白蛋白(BSA)后,香豆素中525,675和1 327 cm-1处的拉曼信号发生红移,拉曼位移1 184,1 230,1 327以及1 563 cm-1处的峰拉曼信号明显减弱,847,897与1 488 cm-1拉曼峰消失.说明加入BSA后,香豆素的结构发生了变化.香豆素与BSA复合物的SERS信号比香豆素本身的SERS信号强度明显减弱,可能是BSA的α-螺旋结构当中被香豆素分子中的平面结构所插入,产生了非共价键π-π堆积的作用,使得香豆素分子中芳环的π电子密度发生改变,进而引起能量的改变,致使SERS信号减弱[17-18]. 525 cm-1和675 cm-1处的拉曼信号发生红移,但并未消失,说明香豆素的骨架振动因与BSA发生作用而受到影响,拉曼位移1 184,1 230,1 327,以及1 563 cm-1处的峰拉曼信号明显减弱,这是由于BSA的加入对香豆素的C—O不对称伸缩振动及C=O的伸缩振动造成了影响,导致位曼峰847,897 cm-1消失,香豆素中芳环平面与BSA作用,使得1 488 cm-1处C—H面内变形振动峰消失,说明香豆素的结构发生了变化.
2.1. PVP背景信号的研究
2.2. 银纳米粒子的SEM形貌表征
2.3. Ag和coumarin与Ag和BSA-coumarin的紫外吸收光谱图
2.4. BSA的NRS与SERS
2.5. 银纳米粒子与BSA不同体积比例的SERS
2.6. 香豆素的NRS与SERS
2.7. 香豆素与BSA相互作用研究
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优化BSA与银纳米粒子体积比为1:3混合时,BSA的拉曼增强信号最强.在低浓度下,银纳米粒子对BSA以及香豆素都有明显的增强效果,其增强效应主要由于BSA中含有孤电子的N原子及二硫键中的S原子与银纳米粒子的结合,以及香豆素中苯环中的π电子及羰基中的氧原子与纳米银发生了吸附作用.以银纳米粒子为表面增强拉曼基底,香豆素可与BSA直接作用,其混合后的复合物的拉曼增强效果有所降低,这是由于香豆素分子中的平面结构插入到了BSA的α螺旋结构中,致使能量发生改变,但峰的位置几乎没变,表明BSA具有较好的立体空间,能与香豆素稳定地结合. SERS作为一种无损的痕量分析手段,具有灵敏度高、分析速度快等优点.利用SERS技术研究BSA与香豆素的相互作用,该方法具有分析时间短,操作简单快速、使用样品量少等优点,为进一步研究增香剂与蛋白分子之间的作用提供了新思路.