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纳米银为基底的表面增强拉曼光谱研究香豆素与牛血清白蛋白的相互作用

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陈蓉, 周光明, 罗丹, 等. 纳米银为基底的表面增强拉曼光谱研究香豆素与牛血清白蛋白的相互作用[J]. 西南大学学报（自然科学版）, 2019, 41(5): 72-79. doi: 10.13718/j.cnki.xdzk.2019.05.012
引用本文: 陈蓉, 周光明, 罗丹, 等. 纳米银为基底的表面增强拉曼光谱研究香豆素与牛血清白蛋白的相互作用[J]. 西南大学学报（自然科学版）, 2019, 41(5): 72-79. doi: 10.13718/j.cnki.xdzk.2019.05.012
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Rong CHEN, Guang-ming ZHOU, Dan LUO, et al. Surface-Enhanced Raman Spectroscopy with Nanosilver as the Substrate to Study the Interaction Between Coumarin and Bovine Serum Albumin (BSA)[J]. Journal of Southwest University Natural Science Edition, 2019, 41(5): 72-79. doi: 10.13718/j.cnki.xdzk.2019.05.012
Citation: Rong CHEN, Guang-ming ZHOU, Dan LUO, et al. Surface-Enhanced Raman Spectroscopy with Nanosilver as the Substrate to Study the Interaction Between Coumarin and Bovine Serum Albumin (BSA)[J]. Journal of Southwest University Natural Science Edition, 2019, 41(5): 72-79. doi: 10.13718/j.cnki.xdzk.2019.05.012
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纳米银为基底的表面增强拉曼光谱研究香豆素与牛血清白蛋白的相互作用

  • 发光与实时分析教育部重点实验室/西南大学 化学化工学院, 重庆 400715

  • 基金项目: 国家自然科学基金项目（21475014）
详细信息
    作者简介:

    陈蓉(1995-), 女, 硕士研究生, 主要从事拉曼光谱研究 .

    通讯作者: 周光明, 教授, 博士研究生导师; 

  • 中图分类号: O657.37

Surface-Enhanced Raman Spectroscopy with Nanosilver as the Substrate to Study the Interaction Between Coumarin and Bovine Serum Albumin (BSA)

  • Key Laboratory of Luminescence and Real-Time Analysis of the Ministry of Education/School of Chemistry and Chemical Engineering, Southwest University, Chongqing 400715, China

  • 摘要: 实验报道了香豆素的拉曼光谱以及在银纳米粒子基底上的表面增强拉曼光谱，并对其特征峰进行了归属，与固体香豆素的常规拉曼进行对比，发现香豆素的特征峰位置基本没变.实验优化了牛血清白蛋白（BSA）与银纳米粒子的体积混合比例，研究了香豆素与BSA相互作用的表面增强拉曼光谱.实验表明，BSA与银纳米粒子体积比为1:3混合时，BSA的拉曼增强信号最佳.在低浓度下，银纳米粒子对香豆素及BSA都有明显的增强效果，其增强效果主要体现在银纳米粒子与香豆素苯环中的π电子、羰基中的氧原子以及BSA中含有孤电子的N原子、蛋白质中二硫键中的S原子发生吸附作用.加入BSA后，香豆素中525，675 cm，和1 327 cm-1处的拉曼信号发生红移，但并未消失，说明香豆素的骨架振动因与牛血清白蛋白发生作用而受到影响；拉曼位移1 184，1 230，1 563 cm-1处的拉曼峰信号明显减弱，这是由于加入BSA后，香豆素的C—O不对称伸缩振动以及C=O的伸缩振动造成的；847，897，1 488 cm-1拉曼峰消失，这是由于香豆素中芳环平面与BSA作用而导致的.与香豆素的表面增强拉曼光谱信号相比，香豆素与BSA复合物的表面增强拉曼光谱信号明显减弱，可能是BSA的α-螺旋结构被香豆素分子中的平面结构所插入，产生非共价键的π-π堆积的作用，使香豆素中芳环π电子密度发生变化，引起能量改变.以银纳米粒子为基底，利用表面增强拉曼光谱考察香豆素与BSA的相互作用，具有分析时间短、操作简单快速、原位无损检测等优点，为香豆素及其他增香剂与蛋白质相互作用的深入研究及其药理研究提供了参考.
    Abstract: The Raman spectrum of coumarin and the surface-enhanced Raman spectrum (SERS) on the silver nanoparticle substrate were reported and the characteristic peaks were assigned. A comparison of SERS with the normal Raman spectrum (NRS) of solid coumarin indicated that the position of the characteristic peak of coumarin was basically unchanged. The experiment optimized the volume mixing ratio of bovine serum albumin (BSA) and silver nanoparticles and studied the SERS of the interaction of coumarin with BSA. The results demonstrated that when the volume ratio of BSA to silver nanoparticles was 1:3, the bovine serum albumin showed the strongest Raman enhancement signal. At low concentrations, silver nanoparticles had obvious enhancement effects on both bovine serum albumin and coumarin. The enhancement effect was mainly reflected in the adsorption of π electrons in silver benzene and coumarin benzene ring, oxygen atom in carbonyl group, N atom containing lone electron in BSA, and S atom in disulfide bond in protein. After the addition of BSA, the Raman signal at 525 cm-1, 675 cm-1, and 1 327 cm-1 in coumarin was red-shifted but did not disappear, indicating that the skeletal vibration of coumarin was affected by the interaction with BSA. The Raman signals at Raman shifts of 1 184 cm-1, 1 230 cm-1, 1 327 cm-1 and 1 563 cm-1 were significantly weakened, due to the C-O asymmetric stretching vibration and C=O stretching vibration of coumarin after BSA addition. The 847 cm-1, 897 cm-1, and 1 488 cm-1 Raman peaks disappeared due to the action of the aromatic ring plane and bovine serum albumin in the coumarin. Compared with the SERS signal of coumarin, the SERS signals of coumarin and bovine serum albumin complex were obviously weakened. The cause might be that the α-helical structure of BSA was inserted by the planar structure in the coumarin molecule, resulting in π of non-covalent bond. The π stacking action changed the π electron density of the aromatic ring in the coumarin, bringing about an energy change. In summery, in this study silver nanoparticles were used as the substrate to investigate the interaction between coumarin and BSA with the SERS technique. The method has the advantages of short analysis time, simple and rapid operation, and in situ nondestructive detection, and provides a reference for the in-depth study of the interaction of other flavoring agents with proteins and its pharmacological research.
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  • 图 1  PVP的SERS背景信号

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    图 2  银纳米粒子的SEM图

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    图 3  紫外吸收光谱

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    图 4  BSA的NRS与SERS

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    图 5  银纳米粒子与BSA不同比例混合的拉曼光谱图

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    图 6  香豆素的结构图

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    图 7  香豆素的NRS与SERS

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    图 8  香豆素固体常规拉曼

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    图 9  拉曼光谱图

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    图 10  香豆素的SERS和香豆素与BSA的SERS

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    表 1  香豆素的拉曼位移及归属

    NRS/cm-1 SERS/cm-1 Assignment
    373(m) 348(w)
    374(w) τ(C—C—C)
    420(w)
    444(s) 449(m)
    487(w) 494(w) Frame deformation vibration
    523(w) 563(w)
    581(w)
    590(w)
    728(m) 686(s)
    761(m) 730(m) γ(C—H)
    763(m)
    888(w) 817(w)
    865(w) brνas(—O—)
    995(w) 936(w)
    br ν(—O—)
    1 028m(s) 1 029(s)
    1 100(w) 1 071(w) νs(C—O—C)
    1 119(m) 1 119(m)
    1 152(m) 1 152(w) νas(C—O)
    1 174(s) 1 178(w)
    1 226(m) 1 224(m)
    1 256(w) 1 277(w) ν(C—O—C)
    1 276(w)
    1 321(m) 1 334(m) δ(C—H)
    1 399(w) 1 382(w)
    1 452(w) 1 448(m)
    1 484(w)
    1 562(s) 1 558(s)
    1 601(s) 1 603(s) ν(C=C)
    1 614(s)
    1 702(s) ν(C=O)
    1 725(w)
    注：τ，扭曲振动；γ，面外弯曲振动；δ，面内弯曲振动；b，环呼吸；ν，伸缩振动；νs，对称伸缩振动；νas，不对称伸缩振动；s，强峰；m，中等强度峰；w，弱峰.
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图( 10) 表( 1)
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出版历程
  • 收稿日期:  2018-08-13
  • 刊出日期:  2019-05-20

纳米银为基底的表面增强拉曼光谱研究香豆素与牛血清白蛋白的相互作用

    通讯作者: 周光明, 教授, 博士研究生导师; 
    作者简介: 陈蓉(1995-), 女, 硕士研究生, 主要从事拉曼光谱研究
  • 发光与实时分析教育部重点实验室/西南大学 化学化工学院, 重庆 400715
  • 收稿日期:  2018-08-13
基金项目:  国家自然科学基金项目（21475014）

摘要: 实验报道了香豆素的拉曼光谱以及在银纳米粒子基底上的表面增强拉曼光谱，并对其特征峰进行了归属，与固体香豆素的常规拉曼进行对比，发现香豆素的特征峰位置基本没变.实验优化了牛血清白蛋白（BSA）与银纳米粒子的体积混合比例，研究了香豆素与BSA相互作用的表面增强拉曼光谱.实验表明，BSA与银纳米粒子体积比为1:3混合时，BSA的拉曼增强信号最佳.在低浓度下，银纳米粒子对香豆素及BSA都有明显的增强效果，其增强效果主要体现在银纳米粒子与香豆素苯环中的π电子、羰基中的氧原子以及BSA中含有孤电子的N原子、蛋白质中二硫键中的S原子发生吸附作用.加入BSA后，香豆素中525，675 cm，和1 327 cm-1处的拉曼信号发生红移，但并未消失，说明香豆素的骨架振动因与牛血清白蛋白发生作用而受到影响；拉曼位移1 184，1 230，1 563 cm-1处的拉曼峰信号明显减弱，这是由于加入BSA后，香豆素的C—O不对称伸缩振动以及C=O的伸缩振动造成的；847，897，1 488 cm-1拉曼峰消失，这是由于香豆素中芳环平面与BSA作用而导致的.与香豆素的表面增强拉曼光谱信号相比，香豆素与BSA复合物的表面增强拉曼光谱信号明显减弱，可能是BSA的α-螺旋结构被香豆素分子中的平面结构所插入，产生非共价键的π-π堆积的作用，使香豆素中芳环π电子密度发生变化，引起能量改变.以银纳米粒子为基底，利用表面增强拉曼光谱考察香豆素与BSA的相互作用，具有分析时间短、操作简单快速、原位无损检测等优点，为香豆素及其他增香剂与蛋白质相互作用的深入研究及其药理研究提供了参考.

English Abstract

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  • 目前市场上的增香剂种类繁多，香豆素就是其中的一类，被广泛用于食品、化妆品等行业[1-2].而动物实验表明香豆素具有致癌性，是一种高毒性的内酯类化合物[3].毒理研究发现香豆素在人体的含量达到一定量时，会给肝脏带来一定的伤害[4]，进而欧洲一些国家对香豆素的添加量做了规定[5-6].牛血清白蛋白(BSA)是一种单链结构蛋白质，既能与亲水性分子结合，也能和疏水性物质结合[7-8]，加之在结构与性能上，BSA与人血清白蛋白有一定的相似性，把它放到模拟人体环境中研究生物效应机理具有一定的指导意义[9].

    目前科研工作人员对香豆素的研究也做了大量的工作，杨树平等人[10]用荧光光谱法研究了不同温度下配合物与BSA的相互作用；陈爱菊[11]运用紫外-可见分光光度法(UV-vis)以及荧光光谱法等探讨了香豆素类抗癌药物与环糊精及BSA在水溶液中的相互作用；Shobini J团队[12]研究了合成香豆素与人血清白蛋白的相互作用；刘雪锋等人[13]利用运用荧光光谱(FS)、紫外光谱(UV)法研究了3种香豆素中药小分子与BSA的相互作用.这些方法虽然灵敏度高，重现性好，但存在背景干扰大、分析时间长、操作复杂等问题.本研究主要以银纳米粒子为基底，表面增强拉曼光谱(SERS)技术具有制样简单、分析时间短等优点，首次运用SERS技术考察香豆素与BSA的相互作用，以进一步从分子层面深入了解香豆素的药效机理.

1.   实验部分

    1.1.   实验主要仪器与试剂

  • FS-100型傅立叶变换拉曼光谱仪(德国Bruker公司)，Nd：YAG激光光源，液氮冷却Ge检测器；UV-2450紫外-可见分光光度计(岛津)；S4800型扫描电子显微镜(SEM)(日本日立公司)；80-1台式低速离心机(金坛科技仪器有限公司).根据Jingjing Ma’steam[14]的方法并稍加修改制备银纳米基底，0.5 mol/L的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)溶液作保护剂，乙二醇作为还原剂，乙二醇(C2H6OH)和PVP，统购于科龙化工试剂厂；根据方艳团队[15]的方法配制Tris-HCI(pH=7.40)缓冲溶液和BSA溶液，BSA购于如吉生物科技；三(羟甲基)氨基甲烷购于天津市科密欧化学试剂有限公司；称取0.05 g香豆素(C8H6O2)溶于无水乙醇，定容到500 mL容量瓶中配制成质量浓度为100 mg/L的香豆素标准溶液，保存备用.以上试剂均为分析纯.

    • 1.2.   SERS检测

  • 测定BSA和香豆素的常规拉曼光谱(NRS)与SERS，并对其峰进行归属；优化银纳米粒子与BSA的体积比，按体积比为4:1，3:1，2:1，1:1，1:2混合后进行拉曼测试；比较Ag和coumarin银纳米粒子为基底，香豆素溶液与Ag和BSA-coumarin银纳米粒子为基底，BSA与香豆素混合溶液混合的SERS.

2.   结果与讨论

    2.1.   PVP背景信号的研究

  • 由于在实验中PVP的使用浓度较高，为避免PVP对后续样品的SERS产生背景信号干扰，因此对PVP溶液进行背景拉曼测试，结果见图 1.从图 1中可以看出，PVP溶液本身并没有SERS背景信号，即在后续的SERS检测过程中，较高浓度的PVP并不会对实验的结果产生任何干扰.

    • 2.2.   银纳米粒子的SEM形貌表征

  • 取少量制好的纳米银稀释后滴加到干净的硅片上，室温下干燥，在加速电压为20 kV的扫描电镜下进行扫描. 图 2是银纳米粒子的扫描电镜(SEM).从图 2中可以明显地看到，银纳米粒子的外形呈棒状，长短大小较为均匀，其粒径大小在80 nm左右[14].银纳米粒子表面能有效吸附目标分子，有较好的拉曼增强效果.

    • 2.3.   Ag和coumarin与Ag和BSA-coumarin的紫外吸收光谱图

  • 通过紫外吸收光谱分别对Ag和coumarin与Ag和BSA-coumarin进行了表征(图 3)，前者的吸收峰在478 nm左右，后者的吸收峰在468 nm左右，吸收峰略微蓝移.这是由于银纳米粒子的等离子体吸收峰与粒子的尺寸、形状和周围的介电常数有关，BSA是一个大的蛋白质，其吸附到银纳米粒子上，改变了它周围的介电环境，导致谱峰蓝移.

    • 2.4.   BSA的NRS与SERS

  • 图 4是BSA的NRS与SERS.从图 4中可以看出银纳米粒子对BSA有明显的增强效果.图中的曲线a是BSA的NRS，没有明显的特征峰出现，图中的曲线b是BSA与纳米银按照最佳体积比例1:3混合所测得的表面增强拉曼光谱，与曲线a相比，曲线b中出现了较多的峰，其中760 cm-1与1 461 cm-1这两个峰有明显的增强. BSA的SERS早有报道[16]，760 cm-1归属于C—H面外变形振动，1 053 cm-1归属于C—N伸缩振动；1 461 cm-1归属于色氨酸残基环中O—C=O对称伸缩振动.

    • 2.5.   银纳米粒子与BSA不同体积比例的SERS

  • 图 5是银纳米粒子与BSA不同体积比例混合的表面增强拉曼光谱图.从图 5中可以看出，当Ag与BSA体积比为3:1时，BSA的拉曼信号最强.在位移为760，1 051，1 460 cm-1处有明显的增强，其760 cm-1处峰最为尖锐，在886 cm-1和930 cm-1左右有小峰出现，随着BSA的加入，可能对物质形成了比较厚的包裹层，拉曼响应明显变弱，因此选用体积比为3:1作为最佳混合比例.

    • 2.6.   香豆素的NRS与SERS

  • 香豆素是一种内酯类化合物，结构见图 6.取一定量的香豆素溶液滴在玻片上，室温下自然晾干，图 7中曲线a是香豆素的NRS.图中曲线b是香豆素的SERS，从图中可以看出曲线a没有明显的峰，而对比NRS，香豆素的SERS峰的强度明显增加，参考《拉曼光谱手册》和《拉曼光谱在有机化学中的应用》这两本书，对香豆素的拉曼峰进行归属，其中348，374 cm-1处的C—C—C的扭曲振动；449，494，563，581，590 cm-1处的骨架变形振动；686，730，763 cm-1处的C—H面外弯曲振动，1 558，1 603 cm-1归属于C=C(芳烃)骨架伸缩振动的特征峰，由于苯环存在π电子共轭体系，可与银纳米粒子发生吸附，峰信号较强；817，865 cm-1处的—O—环呼吸不对称伸缩振动；936 cm-1处的—O—环呼吸对称伸缩振动；1 029 cm-1归属于C—O—C对称伸缩振动，增强效果明显；1 119，1 152，1 178，1 224 cm-1处的C—O不对称伸缩振动；1 277 cm-1处C—O—C伸缩振动，1 382，1 334，1 448 cm-1处的面内变形振动.

    图 8为香豆素固体常规拉曼峰.与香豆素的SERS拉曼峰相比，可以发现峰的位置大致没有改变，只是有些峰发生了移动.其中523 cm-1处的骨架伸缩振动移到了581cm-1，峰型发生了改变；728 cm-1，761 cm-1的C—H面外变形振动移到了730 cm-1和763 cm-1；888 cm-1的峰分裂为817 cm-1和865 cm-1，1 399 cm-1的C—H面内变形振动移到了1 448 cm-1；1 702 cm-1拉曼峰在SERS中消失，这是因为香豆素中C=O与银纳米粒子发生了吸附；其他大多数出峰位置与香豆素的SERS一致.综上可知，以银纳米粒子为基底，香豆素的拉曼峰有明显的增强效果.实验对香豆素的拉曼位移进行了归属，香豆素的拉曼位移及归属见表 1.

    • 2.7.   香豆素与BSA相互作用研究

  • 图 9为体积比为1:5，1:4，1:3，1:2，1:1的Ag和Coumain与Ag和BSA-Coumain的SERS.从图 9中可以看到拉曼峰的位置基本没有什么变化，香豆素的SERS信号在混合体积比为1:1和1:3时，682，968，1 485，1 725 cm-1处拉曼峰不稳定，说明香豆素直接吸附在银纳米粒子表面是不均匀的，当混合体积比为1:4时，拉曼峰的强度较好，表明两者混合比较充分，BSA能稳定吸附香豆素.而BSA与香豆素的复合物吸附在银纳米粒子上，SERS信号相对降低了，但峰的强度基本没有变化，这是由于BSA含有大量的侧链区域和立体的空间结构，能够均匀而稳定有序地吸附香豆素，使得SERS信号更加稳定.

    图 10研究了与BSA作用后香豆素SERS的变化情况. 图 10中a为香豆素的SERS信号，b为Ag和BSA-Coumarin按照体积比为1:4的比例混合后复合物的SERS信号.从图中可以看出当加入牛血清白蛋白(BSA)后，香豆素中525，675和1 327 cm-1处的拉曼信号发生红移，拉曼位移1 184，1 230，1 327以及1 563 cm-1处的峰拉曼信号明显减弱，847，897与1 488 cm-1拉曼峰消失.说明加入BSA后，香豆素的结构发生了变化.香豆素与BSA复合物的SERS信号比香豆素本身的SERS信号强度明显减弱，可能是BSA的α-螺旋结构当中被香豆素分子中的平面结构所插入，产生了非共价键π-π堆积的作用，使得香豆素分子中芳环的π电子密度发生改变，进而引起能量的改变，致使SERS信号减弱[17-18]. 525 cm-1和675 cm-1处的拉曼信号发生红移，但并未消失，说明香豆素的骨架振动因与BSA发生作用而受到影响，拉曼位移1 184，1 230，1 327，以及1 563 cm-1处的峰拉曼信号明显减弱，这是由于BSA的加入对香豆素的C—O不对称伸缩振动及C=O的伸缩振动造成了影响，导致位曼峰847，897 cm-1消失，香豆素中芳环平面与BSA作用，使得1 488 cm-1处C—H面内变形振动峰消失，说明香豆素的结构发生了变化.

3.   结论

  • 优化BSA与银纳米粒子体积比为1:3混合时，BSA的拉曼增强信号最强.在低浓度下，银纳米粒子对BSA以及香豆素都有明显的增强效果，其增强效应主要由于BSA中含有孤电子的N原子及二硫键中的S原子与银纳米粒子的结合，以及香豆素中苯环中的π电子及羰基中的氧原子与纳米银发生了吸附作用.以银纳米粒子为表面增强拉曼基底，香豆素可与BSA直接作用，其混合后的复合物的拉曼增强效果有所降低，这是由于香豆素分子中的平面结构插入到了BSA的α螺旋结构中，致使能量发生改变，但峰的位置几乎没变，表明BSA具有较好的立体空间，能与香豆素稳定地结合. SERS作为一种无损的痕量分析手段，具有灵敏度高、分析速度快等优点.利用SERS技术研究BSA与香豆素的相互作用，该方法具有分析时间短，操作简单快速、使用样品量少等优点，为进一步研究增香剂与蛋白分子之间的作用提供了新思路.

参考文献 (18)

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