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药用植物白及为兰科白及(Bletilla striata)的干燥块茎，是我国一种珍稀名贵的中药材，具有收敛止血、消肿生肌的功效，主治体内外出血等症[1].白及胶还广泛应用于化妆品[2]、生物医学材料[3]、粘合剂[4]等，具有较高的药用价值及工业价值，同时白及花十分鲜艳，也是较好的景观植物，因此市场需求量极大，市场价格也是节节攀升.近年来，由于过度采挖，白及野生资源濒临灭绝，已被列为重点保护的药用植物之一[5-6].
白及的种子细小且无胚乳，在自然情况下难以萌发[7].传统栽培主要靠分株繁殖，其繁殖周期长、效率低，且丰产性及抗逆性容易退化.组织培养技术具有繁殖速度快、效率高等优点，适宜于白及工厂化育苗.许多研究者以白及的块茎、茎尖、芽及根等作为外植体[8-11]进行白及组织培养研究，均获得了组培苗，但普遍存在诱导分化困难、培养时间长等问题，而采用白及种子作为外植体进行组培，消毒方便、操作容易、萌发效率高[12].因此，目前白及的组织培养以种子作为外植体最为普遍，其组培流程通常为：无菌萌发→鳞茎诱导或增殖分化→诱导生根[13-16]，均需至少3个步骤才能完成，培养环节多、成本高，不利于工厂化生产.如何简化培养过程，更加快速获得优质的组培苗等问题亟待解决.本研究以白及种子为外植体，通过无菌萌发后直接进行鳞茎诱导及壮苗培养获得组培苗，同时采用不同激素配比及正交试验，筛选培育白及组培苗的最佳条件，以期建立一套优化的白及快繁体系，为工厂化大规模生产优质种苗提供理论依据及技术支持.
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试验采用的是成熟未开裂的白及蒴果(采于重庆市药物种植研究所标本园，植物分类学研究员刘正宇鉴定为《中国药典》规定的白及种).
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将成熟未开裂的白及果荚流水洗净，然后用75%的酒精进行表面消毒1~3 min，再将果荚置于0.1%的升汞中浸泡15~20 min，无菌水冲洗3~5次，用无菌滤纸吸干表面水分以备接种；在接种盘中采用无菌剪刀将经过消毒的果荚剪开小口，利用无菌接种环蘸取种子均匀地涂抹在不同激素质量浓度配比的萌发培养基上(表 1)，每瓶播种50颗，每种配方培养20瓶，3个重复，以筛选出最佳的萌发培养基.所有培养基pH值为5.8，白糖20 g/L，培养温度为(25±2) ℃，光照强度(1 800±200) lx，光照时间12 h/d，观测种子萌发时间(50%种子萌发时间)，28 d后统计苗高、生根率及出苗率.
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白及种子无菌播种4周，苗高0.7~1.2 cm时转接培养.采用L16(43)正交试验设计，以NAA(A)，6-BA(B)，PP333(C)为因素，每个因素设4个水平(表 2).每瓶转接苗数16株，每种配方转接30瓶，3个重复.所有培养基pH值均为5.8，活性炭0.1 g/L、白糖30 g/L、香蕉泥30 g/L，培养温度为(25±2) ℃，光照强度(2 500±200) lx，光照时间12 h/d.观测鳞茎分化时间(30%白及苗分化出鲜茎所需时间)，60 d后统计鳞茎直径，鳞茎分化率及苗高.
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将组培苗从培养室中移到常温下放置1周，开瓶洗净，定植到苗床上，浇上定根水，并用遮阳率为40%~60%的遮阳网遮阳，每3~5 d浇水1次，注意保持湿度. 30 d左右新根及新叶长出，统计成活率.
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根据苑玉凤[17]的多指标正交试验分析方法，采用排队评分法对正交试验结果进行极差和方差分析.每项指标的最优值定为满分10分，其余指标值按与最优值的差异比例打分，其中鳞茎分化时间最小值记为10分，最大值记为1分；平均苗高、鳞茎分化率、鳞茎直径的最大值均记为10分，最小值记为1分.各试验所有指标的分数之和为综合得分，综合得分越高，说明鳞茎诱导和壮苗培养效果越好.试验数据采用Excel和SPSS 19.0软件进行分析.
1.1. 材料
1.2. 方法
1.2.1. 无菌萌发培养基筛选
1.2.2. 鳞茎诱导及壮苗培养
1.2.3. 移栽与定植
1.3. 数据统计分析
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将灭菌后的白及种子接种于萌发培养基上，结果表明4种萌发培养基对白及种子的萌发影响均极具有统计学意义(p < 0.01).由表 3可知，4号培养基的萌发启动时间为13.37 d，极显著低于其他培养基，其余培养基的萌发时间依次为1 > 2 > 3. 4种培养基的白及苗高和出苗率高低顺序均为4 > 3 > 2 > 1，其中4号培养基白及平均出苗率达93.22%，平均苗高0.8 cm，极显著高于其他培养基(图 1，A).因此，白及种子萌发的较优培养基为1/2 MS+NAA 0.1 mg/L+GA3 0.1 mg/L+白糖20 g/L.
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在白及鳞茎诱导及壮苗培养过程中，不同激素组合对白及鳞茎诱导及壮苗影响较大，其鳞茎分化起始时间、鳞茎直径及分化率等表现出了不同的变化规律，为了筛选出白及鳞茎诱导及壮苗培养基，采用排队法对试验结果进行综合评分，其结果见表 4.
由综合评分结果可知(表 5)，在不同激素配比中白及的生根情况并不一定与综合评分呈正相关，如12，13号培养基，可能由于根系生长过于旺盛，在一定程度上影响了鳞茎分化和生长.因此，本研究以鳞茎分化时间、苗高、鳞茎分化率、鳞茎直径的综合评分作为指标，筛选白及鳞茎诱导及壮苗培养基.
方差分析结果表明，3种激素对白及鳞茎诱导及壮苗具有极显著的影响(表 5).由极差R决定影响程度，其主次顺序为B > A > C，即激素6-BA > NAA > PP333，由此可知激素6-BA对白及的鳞茎诱导及壮苗培养起主要作用，随着6-BA质量浓度增加，综合评分K值呈先增高后降低的趋势，0.8 mg/L时最高.适量添加NAA和PP333对白及的鳞茎诱导及壮苗培养具有促进作用，其质量浓度分别为0.6 mg/L，0.5 mg/L时综合评分最高.在本试验范围内，得到白及鳞茎诱导及壮苗培养基较优的组合为A4B3C2，即1/2 MS+NAA 0.6 mg/L+6-BA 0.8 mg/L + PP333 0.5 mg/L+香蕉泥30 g/L+白糖30 g/L.
本试验中通过培养基1/2 MS+NAA 0.6 mg/L+6-BA 0.8 mg/L+ PP333 0.5 mg/L进行白及的鳞茎诱导及壮苗培养，鳞茎分化启动时间仅20.7 d，60 d后统计鳞茎分化率、平均鳞茎直径、平均苗高分别为91.0%，6.91 mm，6.09 cm，均远高于正交设计中的任何一个组合(图 1，B-D).
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将筛选出的最佳鳞茎诱导及壮苗培养基培养出的白及试管苗，炼苗7 d后移栽至大田，30 d后植株健壮，叶大浓绿，成活率高达95%以上，长势强，后期生长良好(图 2).相比之下，未经鳞茎诱导及壮苗培养基培养的试管苗，移栽后生根情况较差，叶小，成活率不高.
2.1. 萌发培养基的筛选
2.2. 鳞茎高效诱导及壮苗培养基筛选
2.3. 移栽情况
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组织培养具有不受季节限制、生长周期短、生长势明显、不易积累病菌等优势.目前，白及组培苗快繁的体系主要为种子无菌萌发、鳞茎诱导或增殖培养、诱导生根[18]，培养环节多、培养时间长、成本高，同时存在移栽成活率低等问题.本研究以白及种子为外植体，通过优化组培技术，建立了无菌萌发、鳞茎诱导及壮苗培养两段式快繁体系，其中萌发培养基为1/2 MS+NAA 0.1 mg/L+GA3 0.1 mg/L+白糖20 g/L，鳞茎诱导及壮苗最适培养基为1/2 MS+NAA 0.6 mg/L+6-BA 0.8 mg/L + PP333 0.5 mg/L+香蕉泥30 g/L+白糖30 g/L.
组培基本培养基的种类及成分对植物培养效果有着重要的影响，在白及组织培养中主要采用的是MS和1/2 MS培养基.本研究结果表明，1/2 MS培养基比MS更有利于白及种子萌发，这与喻苏琴等[19]、张燕等[15]、王楷等[20]的研究结果一致，可能是由于成熟的白及种子本身存储有一定的营养物质，无需太多营养，同时1/2 MS的有机盐质量浓度偏低，形成的低渗透压环境有机物能够快速分解，更加有利于白及种子的萌发.
6-BA为细胞分裂素，能够促进愈伤组织的诱导及分化，研究表明低质量浓度的6-BA有利于白及种子萌发及芽的增殖，反之则具有抑制作用[7, 21].在本研究中，3种激素对白及鳞茎诱导及壮苗培养均具有极显著的影响，其中以6-BA影响程度最大，试验结果中随着6-BA质量浓度增大，其综合评分之和呈先升高后降低的趋势，其中以6-BA 0.8 mg/L各性状评分之和最高，说明6-BA有利于白及的鳞茎诱导及生长发育，但是质量浓度较高则会产生抑制作用.
PP333是一种生长延缓剂，在组织培养中具有生根壮苗、提高抗逆性的作用[22].但在白及组培中鲜见应用，在本研究中PP333对白及鳞茎诱导及壮苗培养的各性状综合评分之和，随着PP333质量浓度增加，呈先增高后降低的趋势，表明适当添加PP333有利于白及假鳞茎的诱导，培养出健壮的组培苗.
假鳞茎作为营养器官，对白及组培苗的成活率及后期生长发育有着重要的影响.研究表明，白及假鳞茎的形成除与外源激素相关外[23]，还需尽可能延长培养时间[24].本研究在白及种子萌发转接后，直接进行鳞茎诱导和壮苗培养，阻止其分蘖增殖，减少了白及幼苗的营养消耗，从而促进其基部膨大形成假鳞茎，缩短了白及组培育苗周期.本研究建立的白及“两段式”组培快繁体系，培养环节少，90 d即可获得优质健壮的组培苗，适宜于白及工厂化育苗.