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烟草病毒病是烟草上的重要病害之一，是一类分布广泛、危害严重的侵染性病害.烟草病毒病的发生严重影响了烟草的产量和品质，对烟草行业造成巨大的经济损失[1].贵州省是我国烤烟生产第二大省，常年植烟面积在13.33万hm2以上，烟草侵染性病害有31种，平均每年由烟草病虫害造成的产值损失约1.5亿元.目前，我国在烟草上已发现的病毒有17种，危害较严重，发生较普遍的主要有烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus，TMV)、黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus，CMV)、马铃薯Y病毒(potato virus Y，PVY). TMV，CMV和PVY侵染所致的病毒病在贵州烟区分布最广、危害最大，也是毕节烟区的主要病害.据统计，毕节烟区TMV发生情况最为严重，烟草蚜传病毒CMV和PVY发生程度差别较大，这3种病毒造成毕节烟区的年均产值损失约0.78亿元[2-6].目前针对这3种病毒的检测方法主要有指示植物法、电镜诊断法、血清学检测法、核酸分子杂交方法和以PCR为基础的分子生物学方法等[7-9].血清学检测方法特异性差，容易受到外界因素的影响，检测过程花费时间较长，且抗体价格较高[10]；传统的分子生物学方法需要提取植物总RNA，在提取过程中RNA易降解[11]，且提取时间长，成本高.为了加快检测速度，提高检测效率，降低检测成本，本研究利用已建立的浸提液RT-PCR检测体系[12]对采自贵州省毕节市5个烟区的92份样品进行检测，针对3种主要病毒(CMV，TMV和PVY)进行检测和株系鉴定，为毕节烟草病毒病防控提供参考.
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采自贵州毕节烟区(青岗、寨乐、对坡、核桃乡、田桥坝)表现典型病毒病症状的烟草和马铃薯，合计92份，采集后置于实验室-80 ℃超低温冰箱保存备用.
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RNA酶抑制剂RRI、Ex TaqTM DNA聚合酶、逆转录酶M-MLV、10 mmol/L dNTPmix和Trizol等购自大连宝生物公司(TaKaRa)；限制性内切酶购自Promega公司；DNA Marker和DNA纯化试剂购自BioFlux；DNA琼脂糖凝胶试剂盒和pGEM-T载体购自天根科技有限公司.
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取0.5 g叶片于研钵内，加入1 mL PBS充分研磨；将研磨液转移至2.0 mL离心管内，12 000 r/min离心5 min；取5 μL上清液点样于1 cm2大小的PVDF膜上，置于通风橱内晾干，约10 min；将1 cm2的PVDF膜放入2.0 mL离心管内，加入100 μL ddH2O，充分涡旋，置于冰上备用.
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引物根据NCBI已发表基因序列设计，由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成，引物序列见表 1.
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反转录反应体系和条件：20 μL反应管中加入2 μL模板，95 ℃变性3 min，依次加入5×buffer 4 μL、10 mmol/L dNTP mix 0.5 μL、RNA酶抑制剂0.5 μL、引物PVY-R(TCACATGTTCTTGACTCCAAGT) 0.5 μL、反转录酶M-MLV 0.5 μL和ddH2O 12 μL，42 ℃温浴30 min.
PCR反应体系：10×Ex TaqTM Buffer 2 μL，dNTP mix 1 μL，MgCl2 1 μL，引物PVY-F(GCAAATGACACAATGGCATGCAG) 0.5 μL，PVY-R 0.5 μL，Ex TaqTM DNA聚合酶0.25 μL，反转录产物cDNA 1 μL，ddH2O 13.75 μL，共计20 μL.反应条件为：在94 ℃变性4 min，然后依次在94，50，72 ℃的条件下反应30，30，45 s，共计反应35个循环，最后在72 ℃条件下延伸10 min.
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回收RT-PCR产物，与pGEM-T载体连接，转化到大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α，将克隆后经PCR鉴定呈阳性的菌液送至华大基因公司测定序列，对所得的核苷酸序列在GenBank上进行BLAST比对，从NCBI中下载CMV，TMV和PVY各株系代表序列，并且应用MEGA5，DNAMAN和DNAstar等软件对所得序列进行分析.利用DNAstar中的MegAlign软件对CMV CP，TMV CP和PVY CP的核苷酸和氨基酸序列与所下载的代表序列进行同源性比对.采用Neighbor-Jioning法构建系统发育树.
1.1. 样品来源
1.2. 试剂耗材
1.3. 样品浸提液制备
1.4. 引物的设计与合成
1.5. 反应体系
1.6. 克隆、测序及序列分析
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分别利用设计的CMV，TMV和PVY 3种病毒CP特异性引物，对烟草样品进行浸提液RT-PCR检测，产物经过1.5%的琼脂糖凝胶电泳后，在Marker 500 bp和750 bp之间分别出现了预期大小为671 bp和701 bp的CMV和TMV CP条带(图 1a和图 1b).在Marker 750 bp和1 000 bp之间出现了预期大小为802 bp的PVY CP条带(图 1c)，所有结果都与阳性结果一致，而阴性对照中没有产生任何特异性条带.
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对采集的92株疑似携带病毒病的烟草用RT-PCR检测.结果显示，毕节地区的烟草病毒主要为TMV，CMV和PVY.其中，TMV检出率最高，为64.13%；其次是PVY，检出率为40.22%；CMV发生情况较轻，检出率为31.52%. 5个烟区中，PVY在青岗发生最严重，检出率为93.75%；CMV在寨乐发生最严重，检出率为85.00%；TMV在核桃乡发生最严重，检出率为92.86%；对坡镇只检测到TMV的发生(表 2).
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测序结果表明，贵州省毕节市CMV分离物ZL8，TQB7，HTX7，QG3，MQG1和MQG2的CP长度均为671 bp(MQG1和MQG2是烟田周边马铃薯上的CMV分离物).毕节CMV分离物与各代表株系核苷酸同源性比较，分离物与Ⅱ组核苷酸序列的同源性仅为74.1%~76.3%，与IA亚组的核苷酸序列同源性为90.6%~95.1%，与IB亚组的核苷酸序列同源性为92.1%~94.5%.结合进化树可以看出，毕节CMV分离物ZL8，TQB7，HTX7，MQG1和MQG2与来自印度的分离物同源性最高，亲缘关系最近，QG3与来自中国的分离物同源性最高，亲缘关系最近，这6种分离物属于IB亚组(图 2).
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测序结果表明，贵州省毕节市TMV分离物ZL5，DP1，HTX4，HTX7，MQG1和MQG2的CP长度均为701 bp，与各代表株系核苷酸同源性相比较，与种群I的核苷酸同源性为95.7%~97.3%，与种群Ⅱ的核苷酸同源性为73.6%~75.6%.株系进化树分析得出，毕节TMV分离物聚在一个分支，与AF395127(China，Fujian)，AF395128(China)和AF395129(China)的亲缘关系较近，同属于种群I(图 3).
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测序结果表明，贵州省毕节市PVY分离物DP9，HTX4，ZL10，TQB6，MQG1和MQG2的CP长度均为804 bp，与各代表株系核苷酸同源性相比较，与PVYN:O株系核苷酸同源性为98.8%~99.8%，与PVYO株系核苷酸同源性为97%~99.3%，与PVYC株系核苷酸同源性为91.9%~92.8%，与PVYNTN株系核苷酸同源性为90.6%~91.6%，与PVYN株系核苷酸同源性为88%~89.9%，与PVYN:O株系的同源性关系最为密切.结合进化树可以看出，毕节PVY分离物都聚在一个分支，与来自蒙古的分离物同源性最高，属于PVYN:O株系(图 4).
2.1. CMV，TMV和PVY 3种病毒CP的浸提液RT-PCR检测结果
2.2. 毕节田间样品病毒种类的统计与分析
2.3. 毕节烟草病毒株系分析
2.3.1. CMV株系分析
2.3.2. TMV株系分析
2.3.3. PVY株系分析
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病毒的CP序列比较保守，一定程度上其亲缘性可以代表分离物之间的亲缘关系，CP序列的亲缘性越近，分离物的亲缘性越高，划分为同一株系的趋势就越强[13].本研究利用浸提液RT-PCR检测体系，对采自贵州省毕节市5个烟区的92份样品，针对CMV，TMV和PVY进行病害检测和株系鉴定.结果表明，毕节烟区CMV均属于IB亚组，TMV均属于种群I，PVY均属于PVYN:O株系.
CMV株系变异较多，根据抗原特性和核酸序列相似性各株系被分为两个亚组，即亚组I及亚组Ⅱ，同一亚组内分离物CP基因核酸序列相似率达到90%以上，但在两个亚组间分离物的CP基因核酸序列相似率只有70%~80%[14-15].本研究中毕节CMV分离物ZL8，TQB7，HTX7，MQG1和MQG2与来自印度的分离物同源性最高，亲缘关系最近，QG3与来自中国的分离物同源性最高，亲缘关系最近，同属于IB亚组.其中MQG1和MQG2是烟田周边马铃薯上的CMV分离物，在毕节市多数的烟地周围种植马铃薯，而马铃薯部分生长季节与烟草的生长季节部分重叠，且70%的马铃薯地都发生病毒病.由此推测，烟田周边马铃薯可能是烟田CMV的主要毒源.
TMV有很多株系，传统方法是依据寄主症状和寄主范围区分，但TMV分离物在同一寄主上的症状差异可能与环境条件有关，不同分离物的寄主范围，可能由复制酶基因和移动蛋白基因突变决定，因此难以作出具体的划分[16-17].本研究将从NCBI库中选取的不同代表株系划分为两个种群，即种群I和种群Ⅱ.研究结果显示毕节TMV分离物聚在同一分支，与种群I的核苷酸同源性最高，均属于种群I.其中MQG1和MQG2是烟田周边马铃薯上的TMV分离物，与烟草上的TMV分离物亲缘关系较近.据报道，在黑龙江省和重庆市的马铃薯上检测到TMV侵染，而在贵州省引起马铃薯病毒病的主要是马铃薯S病毒(PVS)、马铃薯Y病毒(PVY)和马铃薯X病毒(PVX)等[18-21]，鲜有TMV侵染马铃薯的报道.由此推断，烟田周边马铃薯可能是烟田TMV的毒源.
PVY株系鉴定应用广泛的有鉴别寄主法和基于RT-PCR方法.竞争性荧光RT-PCR鉴定PVYN和PVYC株系.由于PVYN:O和PVYNTN株系是由PVYN和PVYO株系重组或突变而来，因此鉴定PVYN:O和PVYNTN株系应用广泛的方法是普通RT-PCR方法和单克隆抗体[22-23].本研究中，毕节PVY分离物聚在一个分支，与来自蒙古的分离物亲缘关系最近，与PVYN:O株系的核苷酸同源性最高，均属于PVYN:O株系，株系分化不明显，与四川烟区PVY株系分布明显不同[24].其中MQG1和MQG2是烟田周边马铃薯上的PVY分离物，与烟草上的PVY分离物亲缘关系较近，在毕节的纳雍县烟草基地，临近马铃薯的田块的烟草感染PVY的比率明显较高，由此可以推测，烟田周边的马铃薯也可能是烟田PVY的主要毒源.
综上，切断烟田周围作物至烟草的传播途径对防治毕节市烟草CMV，TMV和PVY 3种病毒病具有重要意义.