睾酮，北京索莱宝科技有限公司；睾酮-d₃，SUPELCO公司，纯度均大于98.0%. 甲醇、丙酮、乙酸乙酯、乙腈、正己烷、二氯甲烷，Honeywell公司；甲酸，CNW公司；叔丁基甲醚，Alfa Aesar公司，以上有机试剂均为色谱纯试剂. 中性氧化铝(FCP100-200目)，上海泸试实验室器材股份有限公司；无水硫酸镁(99.95%)，无水硫酸钠(99.95%)，上海麦克林生化科技有限公司，均为分析纯. N-丙基乙二胺(PSA)，杭州微米派科技有限公司；高纯氮气，重庆启迪气体有限公司；Poly-sery HLB(Hydrophilic and Lipophilic Balance)固相萃取柱，CNW公司.

用乙腈将4.00 mg/L的睾酮标准储备溶液逐级稀释，配制成0.05，0.10，0.25，0.50，1.00 μg/mL的标准溶液，混匀后测定，以质量浓度为横坐标，以色谱图峰面积为纵坐标绘制标准曲线.

实验所用河蚬购自重庆市开州区某养殖场，剖取软体组织于离心管中，组织捣碎机捣碎并充分匀浆，-20 ℃保存备用.

目标提取物睾酮为弱极性化合物，本研究分别选用乙酸乙酯、乙腈、叔丁基甲醚、正己烷-二氯甲烷(1∶1)4种提取剂提取睾酮，具体步骤如下：

准确称取(1.00±0.02) g匀浆试样于研钵中(3重样)，加入5 g预烘(110 ℃，12 h)后的无水硫酸钠，研磨至生物样品不粘在研钵上，静置30 min后，转移至50 mL离心管中，并用5 mL提取剂润洗研钵和研磨杵，全部转移至离心管中；加入0.5 mL质量浓度为1 μg/mL的睾酮-d₃，混匀；向离心管中再次加入提取剂5 mL；涡旋振荡提取5 min后，超声10 min；再次涡旋振荡5 min后，静置提取1 h；于4 ℃ 5 000 r/min离心10 min后将上清液转移至新的50 mL离心管中；残渣用5 mL提取剂重复提取2次，合并上清液(共20 mL)，待净化.

针对不同提取剂进行回收率比较分析时，统一采用超低温冷冻离心法净化样品.

超低温冷冻离心：将上清液于-80 ℃冷冻1 h；解冻后，于4 ℃ 10 000 r/min离心8 min；准确移取5 mL上清液于玻璃试管中，氮吹至近干，取乙腈和0.1%甲酸水溶液(9∶1)复溶后，定容至1 mL；过0.22 μm有机滤膜，UPLC-MS/MS测定.

超低温冷冻离心-净化剂：将上清液于-80 ℃冷冻1 h；解冻后，于4 ℃ 10 000 r/min离心8 min；准确移取10 mL上清液于已加入净化剂(0.5 g无水硫酸镁，0.5 g中性氧化铝和0.2 g PSA)的离心管中，涡旋混匀5 min，以10 000 r/min离心5 min后准确移取5 mL上清液于玻璃试管中，氮吹至近干，取乙腈和0.1%甲酸水溶液(9∶1)复溶后，定容至1 mL；过0.22 μm有机滤膜，UPLC-MS/MS测定.

超低温冷冻离心-HLB固相萃取柱：预先用3 mL甲醇和3 mL水先后缓慢通过HLB固相萃取柱使其充分活化；将上清液于-80 ℃冷冻1 h；解冻后，于4 ℃ 10 000 r/min离心8 min；准确移取5 mL上清液于玻璃试管中，氮气吹干后加入3 mL甲醇溶解残渣，并将其转至15 mL离心管中；再用7 mL纯水润洗玻璃试管，合并至离心管中，混匀；取甲醇溶液层以小于2 mL/min的流量通过预先活化的HLB固相萃取柱上样，弃去滤液；再用6 mL的20%甲醇溶液通过HLB固相萃取柱进行淋洗，弃去流出液，抽吸HLB固相萃取柱至近干；用4 mL的90%甲醇溶液对HLB固相萃取柱进行洗脱，收集洗脱液；将洗脱液在50 ℃下氮气吹干后，取乙腈和0.1%甲酸水溶液(9∶1)充分复溶，定容至1 mL；过0.22 μm有机滤膜，UPLC-MS/MS测定.

采用Waters UPLC-Q-TOF-MS ACQUITY UPLC系统在灵敏模式下用正电喷雾(ESI⁺)离子源对睾酮定量. 色谱柱为ACQUITY BEH C₁₈(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，睾酮进样体积为1 μL，恒定流速为0.4 mL/min；流动相由0.1%甲酸溶液(A)和乙腈(B)组成；去溶剂化温度和离子源温度分别为400 ℃和120 ℃，锥形和去溶剂化的流速分别为50 L/h和800 L/h；毛细管电压和锥形电压分别为3 000 V和40 V，MS碰撞能量范围为20~40 eV(图 1).

对实验所得数据用Microsoft Excel 2019进行处理.

本研究考察了乙酸乙酯、叔丁基甲醚、正己烷-二氯甲烷(1∶1)、乙腈4种提取剂对贝类-河蚬组织中睾酮的提取效果. 由表 1可知，乙酸乙酯作为提取剂回收率最高，达101.6%，叔丁基甲醚、正己烷-二氯甲烷(1∶1)、乙腈对睾酮的提取回收率相当，在84.8%~89.4%之间. 4种提取剂中，正己烷-二氯甲烷(1∶1)提取效率最低，可能是正己烷提取油脂杂质较多，不利于净化^[40]. 使用乙腈作为提取剂时相对标准偏差为12.6%，远大于其他3种提取剂，表明乙腈作为提取剂稳定性不足，可能是乙腈能致蛋白质变性，易使样品结块，从而导致回收率不稳定^[41]. 综上所述，4种提取剂中，乙酸乙酯作为提取剂回收率高且稳定，是河蚬组织中提取睾酮的最优选择.

超低温冷冻离心、超低温冷冻离心-净化剂、超低温冷冻离心-HLB固相萃取柱3种净化方法的净化效果见表 2. 结果表明，提取方法相同的情况下，超低温冷冻离心法的回收率为89.4%，高于超低温冷冻离心-净化剂法和超低温冷冻离心-HLB固相萃取柱法. 超低温冷冻离心-HLB固相萃取柱法回收率最低，为77.4%，原因可能是采用固相萃取柱进行萃取损失了部分目标化合物. 结果表明，通过超低温冷冻离心法净化样品，净化效果好、回收率高、操作简便，可作为河蚬组织中睾酮提取后的净化方法.

在选定的色谱/质谱条件下测定质量浓度分别为0.05，0.10，0.25，0.50，1.00 μg/mL的睾酮标准溶液系列，结果表明，睾酮质量浓度在0.05~1.00 μg/mL内与色谱峰面积呈线性正相关，其回归方程为y=390 214x-12 033，R²=0.998 9.

根据信噪比S/N≥3作为检出限，S/N≥10作为定量限，计算得出河蚬组织中睾酮的检出限和定量限分别为6.25 ng/g和20 ng/g.

针对空白基质样品，加标回收实验分别添加睾酮标准物质为低水平(20 μg/kg)、中水平(40 μg/kg)、高水平(200 μg/kg)，进行3次平行实验. 测定结果表明，睾酮的平均回收率为66.4%~101.1%，测定值的相对标准偏差在2.3%~11.6%之间(表 3). 随着加标量的增加回收率不断升高，在国家标准GB/T 27404-2008规定的精密度范围内，方法的准确度和精密度均符合实际分析检测的要求.

因提取所用生物样品多为组织匀浆液，含水率高，基质水分残留对提取净化效果会产生较大影响^[32]. 杨霄等^[14]、李凯华等^[32]研究表明，去除生物样品中的水分有利于提高目标化合物的回收率. 提取前加入无水硫酸钠^[42-43]、提取时加入无水硫酸钠^[32]或无水硫酸镁^[14]、净化前过无水硫酸钠柱^[8]等，均可有效去除水分. 考虑操作简便性及提取液体积的量化问题，本研究中采用预烘后的无水硫酸钠研磨匀浆后的样品，静置至水分吸收完全后加入提取剂提取.

水产品中雄激素的提取常用的提取剂包括乙腈、乙酸乙酯、乙醚、叔丁基甲醚、甲醇、正己烷、乙腈-甲酸/乙酸混合液等^{[22, 24-25, 33]}. 总体而言，在超高液相色谱-串联质谱法测定水产品内睾酮的前处理中，乙酸乙酯作为提取剂的提取效果较好(表 4). 杨帆等^[16]、邹红梅等^[17]、李向军等^[24]研究均发现，鱼类和甲壳类中睾酮的提取使用乙酸乙酯效果最佳，回收率高、稳定性好，优于乙腈、正己烷、甲醇等，与本文关于贝类中睾酮的提取研究结果一致. 此外，邹红梅等^[17]、李向军等^[24]研究还发现，同时提取草鱼中甲基睾酮等多种激素时，乙酸乙酯对大部分目标化合物的提取效率高于甲醇和乙腈. 关于黄鳝、明虾等水产品中甲基睾酮、群勃龙、司坦唑醇等雄激素的提取研究亦表明，乙酸乙酯作为提取剂的提取效率高，且具有不易挥发、毒性较小等优势^{[16, 27, 34, 44]}. 而陈秋华等^[22]研究发现1%乙酸-乙腈作为提取剂提取大黄鱼、南美白对虾、梭子蟹中的雄激素时，提取效果优于乙腈、乙酸乙酯、丙酮. 李凯华等^[32]采用1%乙酸-乙腈提取草鱼中的雄激素，能有效提取目标物. 综上，乙酸乙酯和1%乙酸-乙腈对水生生物体中雄激素提取效果均较好，但雄激素的回收率还与提取对象、雄激素种类、提取方法和净化方法等相关.

提取过程中，可采取涡旋、振荡、超声等方法辅助提升提取效果^[25]. 本文在对睾酮进行提取时采用涡旋振荡-超声-涡旋振荡的方式，一方面超声能增加提取剂的穿透力从而进入细胞内部^[23]，提取率高、操作简便且样品处理量多^[8]；另一方面，振荡可以加速被提取成分的扩散、释放^[25]，使得提取更加充分. 提取过程中，重复提取可提高样品的回收率，以重复1~2次为宜^{[17, 45-46]}.

样品净化方法中，液相萃取除脂法，常采用正己烷、石油醚作为萃取剂. 然而黄鸾玉等^[19]发现正己烷去脂的同时可一定程度溶解睾酮等类固醇激素，故不可避免会造成目标化合物的损失，且由于液相萃取过程中易发生乳化，采用此法净化样品的回收率和精密度均不够理想^{[18, 28]}.

固相萃取柱净化中常采用十八烷基键合硅胶吸附(C₁₈)柱和HLB柱对水产品中的类固醇激素进行纯化. 已有研究表明，HLB固相萃取柱基质可耐受不同的溶剂，使用时回收率不受柱床干涸的影响，且吸附剂表面积较C₁₈柱大，除杂效果更好^[19]. 靳凤龙^[47]在研究动物源性食品中性激素的测定方法时发现，HLB固相萃取柱对性激素的回收率达89.7%~96.6%，是C₁₈柱的1.2倍. 李向军等^[24]发现，采用HLB固相萃取柱净化样品时，可获得较高的回收率，然而，当处理对象为大黄鱼等高油脂样品时，易发生乳化，导致固相萃取柱堵塞. 本研究亦发现，河蚬组织经提取后，以超低温冷冻离心-HLB固相萃取柱作为净化方法时的样品回收率低于其他方法，表明净化过程中目标化合物有损失.

净化剂净化样品时，常用的净化剂包括PSA、中性氧化铝、无水硫酸镁、NaCl等. PSA作为吸附剂能清除许多基质成分，但范小龙等^[37]研究发现仅加入PSA，目标激素的回收率未明显提高，因此可加入其他净化剂共同净化样品. 无水硫酸镁在净化过程中可吸取多余的水分^[37]，中性氧化铝具有良好的除脂能力^[38]，二者与PSA共同净化样品可提高净化效果. 任雪冬等^[38]在测定土壤中激素药物残留时发现以PSA、中性氧化铝及无水硫酸镁为净化剂组合的样品基质干扰最小，回收率最高.

超低温冷冻离心除脂法操作简便、净化效果好、待测激素损失较低^[18]，已被广泛应用于各种基质中类固醇激素的净化. 孟霞等^[34]研究发现，黄鳝甲基睾酮的提取与净化中采用低温冷冻离心除脂，样品回收率达88.1%~105.5%. 低温冷冻离心法常结合其他净化法对提取样品进行纯化. 黄鸾玉等^[19]将冷冻离心结合HLB固相萃取柱净化罗非鱼样品，甲基睾酮的回收率为73.6%~91.4%. 本研究中，超低温冷冻离心净化后，回收率最高，高于超低温冷冻离心-净化剂和超低温冷冻离心-HLB固相萃取柱，表明超低温冷冻离心净化效果好，超低温冷冻后的净化剂净化和HLB固相萃取反而导致样品存在一定程度的损失. 田良良等^[33]在测定鱼虾中丙酸睾酮残留量时亦发现，仅采用超低温冷冻离心法净化样品，丙酸睾酮的回收率为71.2%~104.5%，而超低温冷冻离心与固相萃取柱相结合的方法并没有使杂峰减少，与本研究结果相一致. 使用超低温冷冻离心法净化样品，简化了前处理步骤，简便易操作.

水产品中类固醇激素的检测研究对象多为鱼类和甲壳类，贝类中雄激素测定的研究鲜见报道^{[17, 39]}. 不同于鱼、虾中激素的检测主要针对肌肉中的激素，贝类中激素检测多针对所有软体组织，基质较复杂. 已有研究表明，贝类组织中目标化合物提取的回收率变化范围大. 贝类中关于多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbon，PAHs)、多氯联苯(polychlorinated biphenyls，PCBs)等检测相关文献显示，贝类空白基质加标回收率差异均较大^{[43, 48-52]}. 曹方方等^[42]研究亦表明，花蛤中的有机氯农药p，p'-二氯二苯二氯甲烷(p，p'-dichlorodiphenyl dichloroethane，p，p'-DDD)的回收率为62.3%~106.0%，相对标准偏差为5.6%~21.0%，o，p'-二氯二苯三氯甲烷(o，p'-dichlorodiphenyl trichloroethane，o，p'-DDT)的回收率为73.8%~118.0%，相对标准偏差为4.6%~16.0%.

本文采用乙酸乙酯作为提取剂，超低温冷冻离心作为净化方法提取河蚬中的睾酮，回收率为101.6%，而空白基质加标回收率为66.4%~101.1%，相对标准偏差为2.3%~11.6%，变化范围略大，我们推测可能贝类软体组织样品基质较复杂，自身造成的影响难以避免.

本研究优化了河蚬组织中睾酮质量浓度测定的前处理方法：选取乙酸乙酯作为提取剂，涡旋振荡超声提取，并经超低温冷冻离心净化后利用超高液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)进行定量分析. 该方法简便、快速，且具有较高的准确度和精密度，在20~200 μg/kg加标水平范围内，回收率为66.4%~101.1%，相对标准偏差为2.3%~11.6%，适用于河蚬组织中睾酮的提取测定，也可为其他动物组织中的环境雄激素残留分析提供参考.