Cloning and Expression Analysis of a <i>WRKY</i>41 Gene in Tomato and Its Transfer into a Tomato Cultivar

Juan-juan WEI; Wei YANG; Yu PAN; Xing-guo ZHANG; Jin-hua LI

doi:10.13718/j.cnki.xdzk.2017.01.008

2017 Volume 39 Issue 1

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Juan-juan WEI, Wei YANG, Yu PAN, et al. Cloning and Expression Analysis of a WRKY41 Gene in Tomato and Its Transfer into a Tomato Cultivar[J]. Journal of Southwest University Natural Science Edition, 2017, 39(1): 46-54. doi: 10.13718/j.cnki.xdzk.2017.01.008

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Juan-juan WEI, Wei YANG, Yu PAN, et al. Cloning and Expression Analysis of a WRKY41 Gene in Tomato and Its Transfer into a Tomato Cultivar[J]. Journal of Southwest University Natural Science Edition, 2017, 39(1): 46-54. doi: 10.13718/j.cnki.xdzk.2017.01.008

Cloning and Expression Analysis of a WRKY41 Gene in Tomato and Its Transfer into a Tomato Cultivar

School of Horticulture and Landscape Architecture, Southwestern University/Key Laboratory of Horticultural Science in Southern Mountainous Region, Chongqing 400715, China

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Corresponding author: Xing-guo ZHANG ;
Received Date: 12/01/2016
Available Online: 20/01/2017
MSC: Q785; S641.2

Abstract

Based on the results of microarray transcriptional analysis, a full-length cDNA sequence of the WRKY gene from M82, a cultivar of Solanum lycopersicum, and from the wild species S. pennellii LA0716 by RT-PCR, which were named as SlWRKY41 and SpWRKY41, respectively. Sequence analysis showed that SlWRKY41 and SpWRKY41 gene contained a 1 011-bp open reading frame (ORF) encoding 336 amino acids. As the typical structure features of the WRKY family, a 5′-N WRKYGQK domain and a central zinc finger region CX₇CX₂₃HX₁C were identified in the amino acid sequence of WRKY41 protein. The deduced SlWRKY41 and SpWRKY41 protein was found to be highly homologous to the WRKY proteins from many other plants, and these two putative amino acids shared 97.62% similarity, differing only in five residues. Phylogenetic tree analysis indicated that WRKY41 fell into Group Ⅲ, which is unique to plants. The real-time PCR results suggested that the WRKY41 gene showed differential expression patterns in M82 and LA0716 not only in different tissues and organs but also in various stress or regulator treatments. Interestingly, SpWRKY41 was responded very quickly by SA, GA and Eth. It is conjectured that SpWRKY41 may play a crucial role in resistance to abiotic stress and is a good candidate gene for improving stress-resistance of cultivated tomato. Furthermore, an overexpression vector was constructed, which then successfully transferred SpWRKY41 to tomato M82 to enhance its abiotic tolerance.
- Solanum lycopersicum,
- wild species S. pennellii,
- WRKY41,
- expression pattern,
- drought resistance

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通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com

1.
沈阳化工大学材料科学与工程学院沈阳 110142

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植物在长期进化过程中，会逐步形成对自身有益、适宜自身生长发育的一系列调节机制，转录因子在这些调控过程中具有重要的作用.转录因子也称为反式作用因子，能够与真核基因启动子区域中顺式作用元件特异性结合，并激活或抑制基因的转录^[1]. WRKY作为一种重要的锌指蛋白类转录因子，近年来研究的较为广泛.其编码基因最先在甘薯^[2]中被克隆到，随后约在20多种植物中证实存在WRKY蛋白^[3]. WRKY转录因子最显著的特征是含有一个由60个氨基酸组成的多肽，这个多肽N端至少含有一个WRKY的核心结构域WRKYGQK，C端含有一个非典型的锌指结构^[4].根据WRKY锌指结构的特征及WRKY结构域的数量，将WRKY蛋白分为3类：第Ⅰ类含有1个WRKY结构域，锌指结构为CX_4-5CX_22-23HX₁H；第Ⅱ类含有2个WRKY结构域，其锌指结构是CX_4-5CX_22-23HX₁H，与第Ⅰ类的结构相同；第Ⅲ类与第Ⅰ类同样含有1个WRKY结构域，但是锌指结构不同，为CX₇CX₂₃HX₁C^[4].大多数的WRKY转录因子属于第Ⅱ类，而第Ⅲ类WRKY转录因子一般只存在于高等植物中，并且能响应多种生物胁迫^[5].

近年来，研究发现WRKY基因广泛存在于各个物种中：拟南芥中有72个^[6]，水稻中有102个，大豆中有197个^[7]，番茄中有81个^[8].对这些WRKY基因的表达研究表明，它不仅能在植物受到生物胁迫和非生物胁迫时诱导表达，还能受到外源施加激素的诱导表达.现有的研究表明，WRKY基因在植物生物胁迫或非生物胁迫过程中具有很重要的作用.在生物胁迫方面，超表达辣椒的WRKY基因CaWRKY40能增强烟草对茄科雷尔氏菌的抵抗力^[9]；拟南芥中超表达AtWRKY38和AtWRKY62后，植株对丁香假单胞菌的侵染更加敏感^[10]；同样，将辣椒的一个WRKY基因CaWRKY27在烟草里面超量表达，提高了烟草抗青枯病的能力^[11].在非生物胁迫方面，拟南芥的AtWRKY57通过提高拟南芥ABA水平来增强其对干旱的耐受性^[12]；小麦中的TaWRKY44在烟草中超量表达提高了烟草抗多种非生物逆境的能力^[13]；棉花中的GhWRKY34基因在拟南芥中超量表达提高了其抗盐碱的能力^[14].此外，有些WRKY基因既在生物逆境中又在非生物逆境中有作用，如棉花的GhWRKY25可以调节SA和JA信号途径来降低植物对病原菌的抵抗能力和抗旱能力^[15].

番茄(Solanum lycopersicum)是世界性的重要的蔬菜作物，全球番茄产量达到1.6亿吨，其中超过30%产自我国(FAO，2015)，在我国农业产业中具有重要的地位.随着全球气候变化的加剧，非生物逆境越来越成为农作物产量和品质提高的严重制约因素，也影响着植物的进化和分布^[16-17].利用野生番茄种质资源探索植物抗逆分子机制，可为创造抗逆新品种奠定理论基础及提供实践价值.普通栽培番茄(S.lycopersicum)对干旱和高盐较为敏感^[18]，而其近缘野生种潘那利番茄(S. pennellii)起源于秘鲁安第斯山脉，可在干旱和半干旱环境中生存，对高盐和干旱不敏感^[19].分析抗旱野生种和普通栽培种在干旱响应基因中的差异，通过转基因的方法将野生种相关基因转化到普通栽培番茄种中，是提高栽培番茄抗逆性的一种非常有效的方法.本研究分别从抗旱野生种番茄和栽培番茄中分离出一个WRKY基因，分析了它们的表达特性，并构建了超量表达载体，成功转化进普通栽培番茄M82中，为今后深入研究该基因的抗逆功能和提高番茄的抗逆性奠定基础.

1. 材料与方法

1.1. SlWRKY41基因的克隆和序列分析

基于前期的干旱基因芯片结果，我们分离得到1个在普通番茄栽培品种S. lycopersicum cv. M82和野生番茄品种S. pennellii LA0716在干旱处理下有表达差异的基因WRKY41(Unigene SGN-U212725，https://solgenomics.net).根据Unigene序列，利用Primer Premier 5.0设计引物，用RT-PCR得到基因的全长ORF.在番茄五叶一心时，采集番茄从上到下第三片功能叶，用液氮保存，研磨. RNA采用Trizol(Invitrogen，USA)一步法提取.约1 μg总RNA样品经1U的DNaseI(Fermentas，USA)37 ℃孵育30 min后，加入1 μl EDTA (50 mM)，于65 ℃温育10 min.取各样品总RNA，以Oligo-d(T)为引物，用AMV反转录酶进行反转录，参照PrimeScript® 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)方法进行.扩增基因WRKY41引物对为：WRKY41正向引物5′-TTAGCAACTTTCCCCCTTCA-3；WRKY41反向引物5′-TGAATTCATCGACGTTACAATTT-3′.利用PrimerSTAR HS高保真酶(Takara，大连)按说明书进行PCR扩增. PCR产物经0.8%的琼脂糖凝胶电泳后，回收特异性条带.将回收后的片段与pEASY-Blunt(TransGen)克隆载体进行连接.热击转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆进行测序验证.

利用WRKY41氨基酸序列对NCBI的蛋白质序列数据库进行BLAST，得到序列和其他物种相似性较高的氨基酸序列，然后用ClustalW进行多序列比对.利用SGN(https://solgenomics.net)数据库找出番茄所有的WRKY基因，利用MEGA5.1构建Neighbor-Joining系统进化树.

1.2. SlWRKY41表达模式分析

番茄常规品种M82和野生番茄品种LA0716用于表达分析，常规栽培管理，于2014年5-6月栽培在西南大学蔬菜实验室温室.在植株开花结果时，收集地上部分的茎(ST)、幼叶(YL)、成熟叶(ML)、老叶(OL)花(FL)和果实(FR)，将材料立即放入液氮中速冻，并保存于-80 ℃超低温冰箱备用，用于分析SlWRKY41的组织表达特性.当植株长至五叶一心时取样，用于各种调控因子下的表达分析.各种处理具体如下：干旱脱水(DH)胁迫的是将离体植株放在滤纸上，环境条件为70%的相对湿度，室温25 ℃；ABA(脱落酸)、SA(水杨酸)、GA(赤霉素)处理、Eth(乙烯)和氧化处理，采取直接喷施100 μmol/L ABA、100 μmol/L SA、100 μmol/L GA、1 mM乙烯利(乙烯Eth释放剂)和100 μmol/L的甲基紫精MV(含0.2% Tween-20)，过量喷施，直到叶片滴水为止.每次重复分别采集三棵植株的三片叶，在设计好的时间点收集样品按上述方法保存样品备用.

1.3. 半定量和实时荧光定量PCR

分别提取番茄不同组织器官和各种处理材料的总RNA，并进行反转录，方法如1.1所述.根据Primer 3(http://primer3.ut.ee/)设计半定量和实时定量引物.在WRKY41开放读码框内设计基因引物WRKY41(Q)：正向引物5′-ATTCCCTCCTGCACCACTAC-3，反向引物5′-TAATCCACCCCTTCTCCACC-3，扩增长度213 bp.以番茄β-Actin(SGN-U580609) 作为内参基因校正，正向引物5′-ATGGCAGACGGAGAGGATATTCA-3，反向引物5′-GCCTTTGCAATCCACATCTGCTG-3.半定量首先用β-Actin进行PCR校正各个组织的cDNA(27个循环)，校正一致后，通过目的基因的PCR扩增，通过电泳图来确定基因在各个组织中的表达情况.

实时定量PCR按照SYBR® Premix Ex TaqTM操作说明，在Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪上进行，检测目的基因的相对表达量.荧光定量PCR反应体系为10 μL：2×SsoFast EvaGreen supermix (Bio-Rad) 5 μL，正向反向引物各0.5 μL，cDNA模板2 μL，超纯水2 μL. PCR反应程序为95 ℃预变性3 min，95 ℃变性10 s，58 ℃退火30 s，65 ℃延伸5 s，39次循环.每个试验设置3次重复.为了消除光周期对基因表达的影响，在每个时间点分别取未处理和处理的样品，每个时间点的表达量以未处理的表达量为1，处理之后和未处理相比计算得到相对表达量.

1.4. 转基因植株的获得及鉴定

将1.1得到的SpWRKY41经过克隆质粒用限制性内切酶SalI和KpnI酶切.电泳切胶回收得到目的片段，用T4连接酶连接到用XhoI和KpnI酶切双元载体pBI121的载体框架上.得到的载体经过PCR验证后，抽提好质粒电击法转到农杆菌C58感受态细胞，保存用于番茄的遗传转化.利用农杆菌介导法转化到番茄M82中，具体的操作流程参考欧阳波的方法^[20].得到转基因植株后，利用35S(5′-TTCGCAAGACCCTTCCTCTA-3) 加上基因反向引物进行PCR验证.

3. 讨论

WRKY转录因子广泛存在于植物中，大多数是受外界环境的激发而诱导表达，参与植物生物与非生物胁迫应答反应、植物衰老以及果实发育等一系列生理活动^[21].在本研究中，我们从普通栽培番茄品种M82和野生耐旱番茄潘那利中分别克隆得到了一个WRKY基因WRKY41，命名为SlWRKY41和SpWRKY41(图 1)，这个基因具有典型的WRKY结构域和CX₇CX₂₃HX₁C锌指结构域，这和前人的报道一致^[4].进一步分析发现，来自栽培种和野生种番茄的WRKY在核苷酸序列上是不一样的，核苷酸序列的变异造成5个氨基酸的差异(图 2)，这些氨基酸的差异可能会导致蛋白与蛋白之间的相互作用，从而导致不同近缘种之间的功能差异^[22]，这些变异可能是植物在长期的进化过程中造成的.

进化分析表明，WRKY41属于第Ⅲ类WRKY转录因子，这类转录因子是高等植物所特有的^[23]，响应多种逆境和调节因子.有研究证明，拟南芥基因AtWRKY18经过2 mmol/L SA处理3h后能快速被诱导表达，此时mRNA积累达到高峰^[24].王彦华等研究表明，白菜中获得的WRKY1基因的cDNA片段，在2 mmol/L SA处理4h后被快速诱导表达^[25]. Ryu等在研究中发现水稻中的OsWRKY45和OsWRKY62在SA处理12 h后表达量增加^[26]；厚叶悬蒴苣苔的WRKY基因BcWRKY1在2 mmol/L的SA处理8 h后才被诱导表达，但在24 h后，表达量降低.同样，BcWRKY1可在JA和ABA处理后被诱导表达^[27]；喷洒乙烯利8 h后葡萄的VvWRKY1表达量显著增高，而经过SA处理后2 h才开始表达，但在4 h和8 h后达到最大值^[28].我们从前期干旱芯片中分离出来的这个WRKY基因，经过验证确实受到干旱脱水的诱导表达，并且在栽培番茄品种M82和野生番茄潘那利中表达模式存在差异(图 5)，在M82中，基因处理1 h后表达迅速提高，但在1 h后一直到24 h，基因表达量降低或很难检测到其表达，可能是干旱脱水后，M82植株迅速萎焉，基因不表达或表达量非常低，但是在潘那利中，WRKY41一直稳定上调表达，因为潘那利在干旱脱水的情况下，不会迅速萎焉，推测潘那利之所以抗旱，可能是因为很多抗旱相关基因一直稳定表达所造成的.植物在非生物逆境发生时，自身会生成超氧自由基，并产生氧化逆境，在氧化逆境处理中，WRKY41基因在两个番茄材料中都被诱导表达.同样，在ABA诱导下，WRKY41在两个番茄材料中也被诱导表达，表达模式基本一致.但在SA、Eth和GA的处理下，潘那利番茄中的WRKY41在1 h时便迅速响应而下调表达；而在M82中，该基因在Eth和GA诱导下，无差异表达，在SA诱导下的6 h时才响应并下调表达，这些都说明在潘那利中，WRKY41能迅速响应表达来适应不利的环境.这说明在野生种中，抗逆基因是通过迅速响应不利环境信号来表达的，这个可能在植物抗逆中有着重要的意义.

栽培种番茄经过长期的环境条件以及人工的选择，导致很多重要的抗旱性状遗传基因的等位变异和丢失，造成育种的遗传资源匮乏，也容易出现“平台效应”.有些番茄的野生种由于长期生长在高山、沙漠等极端恶劣的环境中，经过环境的变化与自身的适应性，会使其携带一些抗性基因，因此，利用野生抗逆基因及优异的等位变异，是加速番茄抗逆育种的关键.采用传统的有性杂交育种方式，可以转育野生种的抗性基因到栽培番茄中，但由于连锁累赘问题，通常也会带入一些野生种的不利性状.目前，通过转基因的方法提高植物的抗逆性是最有效的方法之一，我们可以通过分析野生种和栽培种之间重要基因的结构和表达差异，再将来自野生种的基因转化到普通栽培番茄，这将是改良番茄植株的一个有效的方法，本研究已经将来自于潘那利的基因SpWRKY41通过转基因的方法转化到M82中，后期将对其进行功能分析，确定基因功能，改良番茄抗旱性.

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