Study on Polyploid of <i>Dendrobium ochreatum</i> Induced by Colchicine

Ai-hua WANG; Qing-qing WU; Lan YANG; Hong-juan XU; Zhi-lin CHEN

doi:10.13718/j.cnki.xdzk.2017.01.009

Effects of the various colchicine treatments on polyploidy induction of Den. ochreatum were carried out in the current work. The results measured by flow cytometry showed that the most efficient condition of Den. Ochreatum for inducing tetraploids seemed to be treated with 0.01%-0.03% colchicine and octoploids with 0.05%-0.1% colchicine all for 2-3 days. The polyploidies were different from normal diploids in morphology, stoma and chromosome numbers. Compared with tetraploid, octoploid developed more slowly, and more showed bifurcation.

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石斛属(Dendrobium)植物既是我国传统中药材，更是名贵的观赏花卉.近年来，石斛产业发展迅猛，产品一直处于供不应求的状态，且需求有逐年增加趋势.因此，培育优质、高产石斛新种质十分紧迫和必要.多倍体因器官巨大、株型奇特、抗逆性强等特征而被育种家们青睐，已成为目前种质创新研究的热点和重点领域之一.现已获得铁皮石斛^[1]、齿瓣石斛^[2]、粗舌石斛^[3]、金钗石斛^[4]、春石斛及秋石斛杂交种^[5-6]的多倍体.黑喉石斛(Den.ochreatum)嫩茎开花的特性有别于其他石斛品种，即在新芽长成后便立即开花，不需经过冬季的低温处理，大大缩短了开花时间，使之更具有特殊价值，是石斛育种的珍贵材料.目前对于黑喉石斛的研究国内还未见报道.本研究以黑喉石斛的原球茎为材料，采用秋水仙素进行多倍体诱导，以期为石斛种质资源创新提供新材料.

1. 材料与方法

1.1. 材料

黑喉石斛蒴果采自贵州省园艺研究所花卉温室大棚，经体细胞染色体鉴定为二倍体，2n=2x=38.将种子无菌萌发7周后形成的原球茎作为实验材料.

1.2. 多倍体植株诱导

将原球茎浸入含不同质量分数的秋水仙素的液体培养基(1/2MS+30 g/L蔗糖+0.5 mg/L NAA)中(对照不加秋水仙素)，进行不同时间的悬浮培养(表 1)，培养条件为：温度(25±2) ℃，摇床转速100 r/min.原球茎在液体培养后经100目筛子过筛，用无菌水冲洗3遍，用灭菌滤纸吸干水分，再接种于育苗培养基(1/2MS 0.2 g+花宝1号1.5 g+花宝2号1.5 g+Peptone 1.0 g+肌醇0.1 g+1g/L活性炭+30 g/L白糖+4 g/L琼脂+0.5 mg/L NAA)上进行分化培养，每处理接种60株，重复3次，培养瓶置于光照培养室中培养，光培室的温度为(25±2) ℃，光照强度为2 000 lx，每日光照12 h，培养60 d继代1次.

1.3. 多倍体鉴定

1.3.1. 形态观察

待诱导植株分化并长成大苗，取其中10株，用游标卡尺测量叶长、叶宽、株高和茎粗，取平均值.叶型指数=叶长/叶宽.

1.3.2. 气孔观察

分别用无色透明的指甲油涂抹形态明显变异的植株和对照植株的叶片下表皮，待指甲油干燥后，撕取下表皮制片，然后置于Leica显微镜下观察气孔的长度、宽度和密度.气孔长度和宽度取所观察的30个细胞的平均值，气孔及形态数据均使用DPS和Excel软件进行统计.

1.3.3. DNA倍性分析

1.3.3.1. 样品制备

采用Partec CyStain UV Precise T试剂盒，取约0.5 cm²的幼叶于直径55 mm的玻璃培养皿上，加400 μL萃取液，使用尖锐的刀片先纵后横用力切割样品，并浸泡2~5 min，之后将样本及液体用50 μm微孔滤膜过滤到样品管中，再加入1 600 μL DNA染色液，避光染色2~5 min.

1.3.3.2. 数据获取与分析

采用德国Partec公司的CyFlow space流式细胞仪，电压为220 V，UV LED激光波长为365 nm，粒子流速为1.0 μL/s，每个样本至少计数10 000个，重复10次，DNA含量分布曲线由FloMax软件自动生成.以二倍体植株做对照，通过DNA index确定植株倍性，统计不同倍性所占的比率.

1.3.4. 染色体压片分析

切取秋水仙素处理的植株根尖(长约5 mm)，在常温下置于0.7 mmol/L放线菌酮中预处理4 h，洗涤后的根尖先放入Canoy固定液中室温固定15~20 h，然后置于1 mol/L的浓盐酸中，在室温下解离5 min后再在60 ℃恒温下解离8 min，冲洗后用超纯水低渗20 min，最后置于载玻片上，加入1~2滴苯酚品红染色10 min后制片并摄像.

3. 讨论

石斛属植物的多倍体在自然界及离体培养中广泛存在^[7-8]，具有古老的物种进化潜力，既具有短期效果(细胞、器官大小及基因表达的变化)，也具有长期(进化)的影响^[9-11].筛选自然发生的多倍体进行杂交选育，发生频率低，选育周期长，而本实验以黑喉石斛原球茎为实验材料，可以获得足够数量的多倍体，以满足选种需要，且黑喉石斛嫩茎开花的特点大大缩短了育种周期.因此，本实验结果在杂交育种及种质遗传转化体系研究上皆具有重大价值.

秋水仙素的质量分数和处理时间是影响多倍体产生的重要因素，形成不同物种多倍体所需的最佳质量分数和处理时间存在差异. Sarathum等人^[3]报道指出0.075%的秋水仙素处理14 d时，可以获得43.1%的四倍体植株；Vichiato等人^[4]报道指出金钗石斛四倍体产生的适宜质量分数和时间是0.1%和96 h；詹忠根等人^[12]报道指出质量分数为0.05%、处理天数为10 d时，可以获得较多的铁皮石斛四倍体植株.一般而言，适合兰科植物的秋水仙素质量分数在0.05~0.1%之间^[13]，而处理时间的长短取决于实验材料及处理方法.黑喉石斛对秋水仙素较为敏感，处理时间为2~3 d，0.010%~0.030%的秋水仙素质量分数适宜于黑喉石斛四倍体诱导，而稍高的秋水仙素质量分数(0.050%~0.100%)能诱导出黑喉石斛八倍体.多倍体器官巨大、产量高、抗逆性强，但是并不意味着倍数越大越好，本实验中八倍体相较于四倍体，发育更加迟缓，株型奇特，多表现为整株分叉.

黑喉石斛多倍体形态及气孔观察与已有报道一致^[1-2]，均表现出叶色深绿、叶片粗糙、株高下降、茎粗增大、气孔变大和密度变小等特征.对本实验筛选出的四倍体和八倍体植株可育成稳定品种，然后进行杂种优势利用，然而多倍体形成初期并不稳定^[14]，除了生长缓慢^[15]、严重不育外，还存在回复成二倍体的可能性，因此有必要对其进行扩繁稳定和育苗移栽，有目的地筛选出生长较快、抗逆性强的多倍体植株，形态及倍性筛选也应延续几个世代.

Figure (4) Table (3) Reference (15)

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通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com

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