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基于COI基因序列的日本医蛭疑似种鉴定

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余米, 苏胜齐, 周梦, 等. 基于COI基因序列的日本医蛭疑似种鉴定[J]. 西南大学学报（自然科学版）, 2022, 44(10): 74-80. doi: 10.13718/j.cnki.xdzk.2022.10.009
引用本文: 余米, 苏胜齐, 周梦, 等. 基于COI基因序列的日本医蛭疑似种鉴定[J]. 西南大学学报（自然科学版）, 2022, 44(10): 74-80. doi: 10.13718/j.cnki.xdzk.2022.10.009
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YU Mi, SU Shengqi, ZHOU Meng, et al. Identification of Suspected Species of Hirudo nipponica Based on COI Gene Sequence[J]. Journal of Southwest University Natural Science Edition, 2022, 44(10): 74-80. doi: 10.13718/j.cnki.xdzk.2022.10.009
Citation: YU Mi, SU Shengqi, ZHOU Meng, et al. Identification of Suspected Species of Hirudo nipponica Based on COI Gene Sequence[J]. Journal of Southwest University Natural Science Edition, 2022, 44(10): 74-80. doi: 10.13718/j.cnki.xdzk.2022.10.009
shu

基于COI基因序列的日本医蛭疑似种鉴定

  • 1.

    重庆市药物种植研究所, 重庆 南川 408435

  • 2.

    西南大学 水产学院, 重庆 400715

  • 3.

    特色生物资源研究与利用川渝共建重点实验室, 重庆 南川 408435

  • 基金项目: 重庆市科技局技术创新与应用发展项目(cstc2019jscx-msxmX0357, cstc2019jscx-dxwtBX0021); 重庆市卫健委“药用动物学”重点学科建设项目
详细信息
    作者简介:

    余米，助理研究员，主要从事药用水生动物繁育的研究 .

    通讯作者: 曹敏，助理研究员; 

  • 中图分类号: S917

Identification of Suspected Species of Hirudo nipponica Based on COI Gene Sequence

  • 1.

    Chongqing Institute of Medicinal Plant Cultivation, Nanchuan Chongqing 408435, China

  • 2.

    College of Fisheries, Southwest University, Chongqing 400715, China

  • 3.

    Bio-resource Research and Utilization Joint Key Laboratory of Sichuan and Chongqing, Nanchuan Chongqing 408435, China

  • 摘要: 采用线粒体COI(细胞色素氧化酶I亚基, tochrome oxidasesubunit I)基因序列鉴别日本医蛭及其常见疑似种, 并分析其遗传多样性和亲缘关系. 以日本医蛭及其疑似种为材料, 提取线粒体DNA, 扩增其COI基因后进行测序, 并计算遗传距离和聚类分析. 结果显示, 日本医蛭COI序列长度为680 bp, 碱基A, T, C, G质量分数分别为35.1%, 28.7%, 16.2%和20.0%, 碱基AT质量分数为63.8%; 疑似种YS1~YS10的碱基A, T, C, G平均质量分数分别为39.8%, 29.4%, 15.2%和14.9%, 碱基AT质量分数为69.2%. 11种蛭类COI序列中有569个一致位点, 84个变异位点, 其中, 40个位点发生了碱基转换, 44个位点发生了碱基颠换, 转换与颠换的比值为0.90. 日本医蛭与疑似种的遗传距离在0.159~0.166之间. 基于COI序列的DNA条形码技术可以很好地鉴定正品日本医蛭与其疑似种, 本试验鉴定的疑似种均不是日本医蛭.
    Abstract: The mitochondrial COI gene sequence was used to analyze the genetic diversity and relationship between Hirudo nipponica and its suspected species. The mitochondrial DNA of H. nipponica and its suspected species were extracted. The COI gene were amplified and sequenced. Genetic distance and relationship were analyzed. The results showed that the sequence length of COI of H. nipponica was 680 bp. The contents of A, T, C and G were 35.1%, 28.7%, 16.2% and 20.0%, respectively, with 63.8% of AT content. The average contents of A, T, C and G in YS1~YS10 were 39.8%, 29.4%, 15.2% and 14.9%, respectively, with 69.2% of AT content. There were 569 consensus sites, 84 variation sites in 11 Hirudo species. Among them, 40 loci had base conversion and 44 had transversions. The ratio of conversion versus transversion was 0.90. The genetic distance between H. nipponica and 10 suspected species ranged from 0.159 to 0.166. DNA barcoding technology based on COI sequence can be used to identify authentic H. nipponica and its suspected species. All the suspected species identified in this study were not H. nipponica.
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  • 图 1  日本医蛭及疑似种背部图

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    图 2  11种蛭类COI-PCR扩增图

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    图 3  基于COI基因序列构建的NJ系统进化树

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    图 4  基于COI基因序列构建的ML系统进化树

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    图 5  3种蛭类的抗凝血酶活性

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    表 1  11类蛭类COI基因的碱基组成

    物种 碱基组成/% AT质量分数/ % 序列长度/ bp
    A T C G
    CK 35.1 28.7 16.2 20.0 63.8 680
    YS1 39.8 29.2 15.9 15.1 69.0 684
    YS2 39.8 29.2 15.9 15.1 69.0 684
    YS3 39.8 29.4 15.9 14.9 69.2 684
    YS4 39.8 29.5 15.8 14.9 69.3 684
    YS5 39.6 29.4 16.2 14.8 69.0 681
    YS6 39.8 29.5 15.8 14.9 69.3 684
    YS7 39.5 29.2 16.2 15.1 68.7 684
    YS8 39.9 29.4 15.9 14.8 69.3 684
    YS9 40.2 29.5 15.7 14.5 69.7 681
    YS10 39.9 29.5 15.8 14.8 69.4 684
    平均值 39.8 29.4 15.2 14.9 69.2 683
    注：平均值为YS1~YS10的平均值.
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    表 2  COI序列碱基替换

    密码子位点 一致位点 转换位点 颠换位点 R
    第一位点/个 198 15 5 2.93
    第二位点/个 156 24 38 0.63
    第三位点/个 214 2 2 0.78
    平均/个 569 40 44 0.90
    注：R为转换位点与颠换位点全数据的比值.
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    表 3  11种蛭类的COI基因的遗传距离

    CK YS1 YS2 YS3 YS4 YS5 YS6 YS7 YS8 YS9 YS10
    CK -
    YS1 0.166
    YS2 0.163 0.003
    YS3 0.160 0.012 0.009
    YS4 0.160 0.013 0.010 0.001
    YS5 0.161 0.012 0.009 0.001 0.003
    YS6 0.162 0.013 0.010 0.001 0.003 0.003
    YS7 0.159 0.025 0.022 0.025 0.026 0.025 0.026
    YS8 0.159 0.013 0.010 0.001 0.003 0.003 0.003 0.026
    YS9 0.164 0.012 0.009 0.009 0.007 0.010 0.010 0.024 0.010
    YS10 0.163 0.012 0.009 0.009 0.007 0.010 0.010 0.025 0.010 0.000 -
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出版历程
  • 收稿日期:  2021-03-08
  • 刊出日期:  2022-10-20

基于COI基因序列的日本医蛭疑似种鉴定

    通讯作者: 曹敏，助理研究员; 
    作者简介: 余米，助理研究员，主要从事药用水生动物繁育的研究
  • 1. 重庆市药物种植研究所, 重庆 南川 408435
  • 2. 西南大学 水产学院, 重庆 400715
  • 3. 特色生物资源研究与利用川渝共建重点实验室, 重庆 南川 408435
  • 收稿日期:  2021-03-08
基金项目:  重庆市科技局技术创新与应用发展项目(cstc2019jscx-msxmX0357, cstc2019jscx-dxwtBX0021); 重庆市卫健委“药用动物学”重点学科建设项目

摘要: 采用线粒体COI(细胞色素氧化酶I亚基, tochrome oxidasesubunit I)基因序列鉴别日本医蛭及其常见疑似种, 并分析其遗传多样性和亲缘关系. 以日本医蛭及其疑似种为材料, 提取线粒体DNA, 扩增其COI基因后进行测序, 并计算遗传距离和聚类分析. 结果显示, 日本医蛭COI序列长度为680 bp, 碱基A, T, C, G质量分数分别为35.1%, 28.7%, 16.2%和20.0%, 碱基AT质量分数为63.8%; 疑似种YS1~YS10的碱基A, T, C, G平均质量分数分别为39.8%, 29.4%, 15.2%和14.9%, 碱基AT质量分数为69.2%. 11种蛭类COI序列中有569个一致位点, 84个变异位点, 其中, 40个位点发生了碱基转换, 44个位点发生了碱基颠换, 转换与颠换的比值为0.90. 日本医蛭与疑似种的遗传距离在0.159~0.166之间. 基于COI序列的DNA条形码技术可以很好地鉴定正品日本医蛭与其疑似种, 本试验鉴定的疑似种均不是日本医蛭.

English Abstract

    全文HTML

  • 开放科学(资源服务)标志码(OSID):

  • 日本医蛭(Hirudo nipponia)俗称水蛭、日本医水蛭或稻田医蛭等，隶属于医蛭形亚目(Hirudiniformes Caballero)、医蛭科(Hirudinidae Whitman)、医蛭属(Hirudo)，在我国众多省份均有野生资源分布[1]，其人工养殖地主要集中在山东、重庆、广东以及东北各省市[1-2]. 日本医蛭是《中华人民共和国药典》收录的唯一的吸血蛭，在我国最早被应用在断指再植、皮肤撕脱伤和解除皮瓣瘀血的研究中[3-4]；又因其咽周体含有高效抗凝血物质(水蛭素和肝素)，被作为心脑血管疾病药物的主要动物原材料. 虽然近年来日本医蛭人工养殖与繁育取得了一定的突破[2, 5]，但人工养殖产量依然不能满足市场的需求，其药材伪混现象严重，常以外形和习性相似的其他蛭类冒充日本医蛭，替代品以菲牛蛭为主[6-7]. 因此对基于COI的日本医蛭疑似种进行鉴定，有利于以日本医蛭为原料的中成药的基原保证.

    《中国动物志·环节动物门·蛭纲》记录：不同蛭类的种间鉴定主要通过背部纵纹的颜色、数量和形状，雌雄生殖孔所在位置以及阴道囊的形状等来区分[1]. 但其外部形态和体色易受环境影响，因此传统鉴定方法具有不确定性，而分子鉴定具有快速、准确等特点，在蛭类的鉴定中已有报道，且多用于蛭类种间遗传距离和遗传多样性分析[8-10]. COI是动物线粒体氧化呼吸链中的重要基因，在蛭类种群遗传结构和分子系统发育等研究方面应用广泛. 已有学者应用COI序列分析了日本医蛭、宽体金线蛭、尖细金线蛭、光润金线蛭、日本山蛭、菲牛蛭、棒纹牛蛭、八目石蛭等物种的亲缘关系[11-12]. Borda等[13-14]采用COI序列研究《中国动物志·环节动物门·蛭纲》中多个物种，发现传统分类与系统分类进化结果存在一定的差异. 目前，蛭类COI序列的研究主要集中在对已知蛭类品种亲缘关系的分析上，关于日本医蛭疑似种的鉴定尚无研究报道. 现以市场上流通的日本医蛭疑似种为研究对象，测定COI序列，比较其序列特征并检验其利用COI序列鉴别日本医蛭与其疑似种的可行性.

1.   材料与方法

    1.1.   试验材料

  • 试验组样品购买于山东省鱼台县王庙镇水蛭市场，根据其背部形态分为10类，每一类至少5个样本完全一致，依次编号为YS1~YS10(图 1)，对照组日本医蛭(CK，5个样本)为重庆市药物种植研究所养殖，共计11类. 根据背部形态选取每类1尾水蛭进行解剖取肌肉组织，将组织样品附着的血液冲洗干净，置于-80 ℃冰箱中保存备用，其余样品备用.

    • 1.2.   样本DNA提取、PCR扩增及测序

    1.2.1.   DNA提取和目的基因扩增

  • 采用天根海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，并对线粒体COI基因片段进行PCR扩增. 使用的上游引物LCO1490(5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′)和下游引物HCO2198(5′-TAAACTTCAGGGTGACCCAAAAAATCA-3′)由北京天一辉远生物科技有限公司合成[15]. PCR扩增的反应体系为40 μL，包括20 μL 2x EasyTaq PCR SuperMix，上、下游引物各1.5 μL，DNA模板1 μL，16 μL ddH2O. 反应条件：95 ℃预变性1 min；95 ℃变性1 min，45 ℃退火1.5 min，72 ℃延伸1.5 min，5个循环；95 ℃变性1 min，50 ℃退火1.5 min，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃总延伸5 min. PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图 2.

    • 1.2.2.   测序结果

  • 测序结果采用DNAstar 7软件中的SeqMan进行序列拼接，拼接获得单个个体完整的序列后，利用MAGE 5.0软件的Align功能进行多序列比对，将比对结果保存为.meg文件构建NJ(邻位相连法：neighbor_joining)和ML(最大似然法：maximum likelihood)进化树. 对照组COI基因序列登录号为GQ368749.1.

    • 1.3.   不同种蛭类的抗凝血酶活性测试

  • 根据COI基因的鉴定结果，抗凝血酶活性试验分为CK组、YS7组以及其他组(YS1~YS10，除YS7)，每组样本总质量2 g以上，3次重复，参照《中华人民共和国药典》中水蛭抗凝血酶活性的方法进行测试[16].

2.   结果与分析

    2.1.   11种蛭类COI序列分析

  • 11种蛭类的COI基因碱基组成如表 1，CK的COI序列长度为680 bp，碱基A，T，C，G质量分数分别为35.1%，28.7%，16.2%和20.0%，碱基AT质量分数为63.8%，YS1~YS10的碱基A，T，C，G质量分数分别为39.8%，29.4%，15.2%和14.9%，碱基AT质量分数为69.2%. 在所测的种类中CK的AT质量分数最低，序列最短，YS5和YS9序列长度为681 bp，其余种序列长度均为684 bp. 在所测的11种蛭类COI序列中有569个一致位点，84个变异位点，其中40个位点发生了碱基转换，44个位点发生了碱基颠换，转换主要发生在AG之间，颠换主要发生在AT之间，转换与颠换的比值为0.90(表 2).

    • 2.2.   遗传距离与系统发育

  • 11种蛭类的平均遗传距离(表 3)为0.038，日本医蛭与被测试的10种蛭类的遗传距离均大于0.159. YS4，YS5，YS6，YS8与YS3的遗传距离均为0.001，YS1与YS2的遗传距离为0.003，YS9与YS10的遗传距离为0.000. 结合NJ和ML系统发育树(图 3，图 4)YS3，YS4，YS5，YS6，YS8聚为一大类，YS1，YS2，YS9，YS10聚为一类，对照组日本医蛭均不与疑似种聚为一类. 除YS7外，YS1~YS10的平均种间遗传距离为0.007，小于0.020，说明这9个物种属于同一物种. CK与YS1~YS10(不包括YS7)之间的平均种间遗传距离为0.162，YS7与YS1~YS10之间的平均遗传距离为0.025，是YS1~YS10平均种内遗传距离的3.749倍.

    • 2.3.   不同种蛭类的抗凝血酶活性

  • 分别对养殖的日本医蛭类、鉴定的YS7类以及其他类吸血蛭进行抗凝血活性测定，结果显示，YS7类和其他类吸血蛭均有较强的抗凝血酶活性(图 5).

3.   讨论

  • 水蛭的鉴定主要有基于其形态特征和DNA分子鉴定两种方式，形态特征鉴定主要根据其外部形态和生殖器官的形状来区分[17-19]，而DNA分子鉴定主要是PCR技术和DNA条形码技术[20]. 目前基于COI序列的DNA条形码技术已被广泛应用于药用水蛭的分类以及水蛭相关中成药的基原鉴定中[21]. 相较于传统的形态特征鉴定方法，基于COI序列的DNA条形码技术具有快速准确等优点，能有效避免因为形态的相似性造成的误认.

    本试验中被测序的11种水蛭，其COI序列长度为680~684 bp，碱基AT质量分数在63.8%~69.7%之间，与徐云玲等[11]的研究结果类似. 本试验所测样品碱基均存在明显的偏好性，且YS1~YS10的AT质量分数明显高于CK(日本医蛭)的AT质量分数. 李咏梅等[22]认为在动物线粒体DNA的变异中，近亲种间更容易频繁发生转换，而颠换则更容易发生在远缘种间. 本试验结果转换与颠换的比值为0.90，说明本试验所鉴定的水蛭品种与日本医蛭亲缘关系较远. 根据软件MEGA 5.0计算11种蛭类种间遗传距离，在ML和NJ系统进化树中CK与YS7遗传距离最近，所测其他疑似种则聚为一大类，其平均种间遗传距离为0.007＜0.020，Hebert等[23]认为鉴定最小种间遗传距离为0.020，说明这9个样品属于同一物种. CK与YS1~YS10(不包括YS7)之间的平均种间遗传距离为0.162. YS7与YS1~YS10之间的平均遗传距离为0.025，是YS1~YS10平均种内遗传距离的3.749倍，并没有达到10倍以上. 综上所述，被测的11种水蛭中，CK与疑似种的亲缘关系较远，YS7为一物种，另外9种蛭类为同一物种.

    测试的疑似种均来源于山东鱼台县，其外部形态与丽医蛭(只分布在浙江省)差异较大，可以断定所测试的疑似种并不是丽医蛭，且根据本文的结果可以判定为2个新种. 《中国动物志·环节动物门·蛭纲》中记载了我国蛭类共有93种，其中吸血蛭有日本医蛭、丽医蛭、菲牛蛭、南京牛蛭、湖北牛蛭、棒纹牛蛭、天目山蛭等. 而杨谋等[7]认为日本医蛭是传统中医使用品种和医学古典中记录的品种，加之日本医蛭的抗凝血活性远远高于非吸血蛭[24-26]，因此具有较高的生态和经济价值. 但由于我国耕作方式的改变使连续性水体成为了季节性水体，严重影响了日本医蛭的生存环境[7]，加之历史上为发展农业对稻田水域日本医蛭的大量捕杀[27]，以及现有养殖模式相对落后等因素，导致其资源量远不能满足市场需求. 而在山东鱼台境内YS1~YS10的野生资源相对丰富，且抗凝血酶活性较强，表明了这2种水蛭具有较高的潜在利用价值，可作为日本医蛭的补充替代品种进行深入研究.

4.   结论

  • 基于COI序列的DNA条形码技术可以很好地鉴定正品日本医蛭与其疑似种，本试验鉴定的疑似种均不是日本医蛭.

参考文献 (27)

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