下载:
-
开放科学(资源服务)标识码(OSID):
-
家蚕是我国的重要经济昆虫，已经有5 000年的驯化历史. 近年来，家蚕成为了典型的鳞翅目模式昆虫，对家蚕的基础研究可为研究其他鳞翅目昆虫提供重要的理论支撑. 家蚕具有开放式血淋巴循环系统，组织器官浸润于血淋巴中. 血淋巴在营养物质转运、废物运输等方面发挥着至关重要的作用. 家蚕血淋巴中有几百种蛋白质，这些蛋白质主要分为2大类：营养储存蛋白和免疫相关蛋白[1]. 营养储存蛋白主要包括载脂蛋白、贮藏蛋白、卵黄原蛋白和30K蛋白. 30K蛋白是序列高度同源且分子量在30K左右的一群蛋白，在家蚕血液和胚胎中含量非常高[2-6]. 家蚕30K蛋白的功能研究将有助于我们理解30K蛋白在血液和胚胎中的作用.
2007年，SUN等[7]利用家蚕的EST数据对30K蛋白基因进行了鉴定，共鉴定到10个基因. 2012年，ZHANG等[8]利用家蚕基因组精细图序列数据，确定家蚕中共有46个基因编码30K蛋白. 根据进化分析和结构域分析，可以将30K蛋白分为3个家族：ENF肽结合蛋白、富含丝氨酸和苏氨酸的30K蛋白和典型30K蛋白. 典型30K蛋白分子量约为30 kDa，共有24个成员. 对4龄和5龄家蚕血液进行蛋白质组学分析，结果表明典型30K蛋白在5龄家蚕血液中高量存在，尤其是BmLP1和BmLP2[1]. 已有研究表明，BmLP1有多种生物学功能，在胚胎的正常发育中具有重要作用[9]. BmLP1可以与糖结合，如甘露糖、葡萄糖、N-乙酰葡糖胺[10]和葡聚糖，葡聚糖是病原体表面携带的重要糖分子，BmLP1可以结合葡聚糖，暗示其可能参与了昆虫的免疫[11-12]；YE等[13]证实BmLP1可以与血细胞膜结合，通过促进血细胞包囊及黑化反应参与家蚕免疫；BmLP1可以结合EcR-B1，从而抑制蜕皮激素诱导的细胞凋亡[14]. ZHANG等[9]对BmLP7进行了详细研究，发现BmLP7主要由5龄家蚕的脂肪体合成，然后分泌进入血液中，再转运进入卵巢中，最终在胚胎发育过程中被胚胎肠腔内的酶降解，为胚胎发育提供能量和氨基酸. 近期有研究表明，BmVgR(家蚕卵黄原蛋白受体)可以与BmLP1结合，将BmLP1转运进入卵巢. 2016年，WANG等[15]从5龄家蚕消化液中纯化获得碱性丝氨酸蛋白酶P-IIc，该酶在胚胎后期表达，将该蛋白酶与不同30K蛋白孵育后，发现其具有强烈水解30K蛋白的功能.
30K蛋白成员众多，且在生物学功能上呈现出丰富的多样性. 前期研究了30K蛋白BmLP7的表达模式与功能，为了系统地比较与分析不同30K蛋白的功能差异，有必要对BmLP1等其他30K蛋白进行研究. 本研究利用半定量RT-PCR，Western blotting，免疫组化等技术，对家蚕30K蛋白BmLP1在不同组织器官中的表达模式进行调查和分析，旨在揭示家蚕BmLP1蛋白的合成、转运与利用情况，阐明家蚕30K蛋白在胚胎发育中的功能.
全文HTML
-
家蚕大造为本研究的实验材料，由西南大学提供. 大造采用常规饲喂方法饲养，饲喂的相对温度为25 ℃，相对湿度为60%.
Trizol试剂购于Invitrogen公司；dNTPs，Oligo (dT)，M-MLV反转录酶购于Promega公司；羊抗兔二抗购于Sigma公司；Tubulin抗体、FITC染色液和抗荧光淬灭封闭液购于碧云天；DAB显色试剂盒购于北京中杉金桥；PVDF膜购于Roche；苯基硫脲、考马斯亮蓝、甘氨酸等试剂购于上海生工；松油醇、二甲苯、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、甲醇及冰醋酸等试剂购于重庆化学试剂厂.
-
在Silkdb数据库(
http://silkworm.swu.edu.cn/silkdb/ )下载30K蛋白BmLP1，BmLP2，BmLP3和BmLP7的氨基酸序列[16]，利用ClustalX 1.83软件进行多序列比对分析[17]，并利用GeneDoc软件进行手动校正. -
收集不同发育时期的家蚕脂肪体材料放于-80 ℃冰箱中保存备用. 家蚕的发育阶段共8个，分别为：5龄第3 d，5龄第5 d，5龄第7 d，上蔟第2 d，化蛹第1 d，化蛹第4 d，化蛹第7 d和化蛾第1 d. 利用Trizol试剂提取脂肪体的总RNA，反转录为cDNA. 利用cDNA为模板进行PCR扩增，扩增所用引物见表 1，扩增条件为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性40 s；54 ℃退火40 s；72 ℃延伸40 s；循环28次；72 ℃再延伸10 min；最后置于12 ℃保存.
-
家蚕发育至5龄第1 d时，鉴定性别，取雌性家蚕作为实验材料. 在5龄期和上蔟期，先用解剖针扎家蚕腹足，收集血液，并加入少量的苯基硫脲防止血液黑化，再取家蚕的卵巢组织存放于-80 ℃冰箱中. 在蛹期和蛾期，将家蚕固定于蜡盘上，用20 μL枪头吸取血液置于离心管中保存，再取其卵巢组织保存于-80 ℃冰箱中. 血液样品用0.1 mol/L PBS溶液稀释5倍待用. 卵巢样品采用液氮研磨的方法研磨成粉末状，加入适量的0.1 mol/L PBS溶液溶解.
利用Brandford法对血液样品和卵巢样品进行定量分析，并以牛血清白蛋白(BSA)绘制标准曲线. 根据定量结果，取2 μg蛋白质样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析，凝胶浓度为12.5%. 将血液和卵巢样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳后，通过湿转法将蛋白转移至PVDF膜上，转膜条件为200 V，转膜时间为30 min. 待转膜完成后，将膜放置在培养皿中，用5%的脱脂奶粉封闭1 h后，倒掉封闭液，加入一抗溶液孵育2 h，用TBST溶液清洗4次，再加入二抗溶液孵育2 h，再用TBST溶液清洗4次. 最后将PVDF膜浸泡在显色液中，避光反应5 min，放入曝光仪中曝光.
-
当蚕卵发育至第6 d和第10 d时，取适量的卵放入10% KOH溶液中软化，然后置于Smith固定液中24 h，接着用乙醇梯度脱水，用松油醇处理，使之变得透明. 最后，将处理好的蚕卵包埋进石蜡中，用石蜡切片机进行切片，切片厚度设置为5 μm. 石蜡切片经过脱蜡、乙醇复水、去除内源性过氧化物酶、抗原修复、封闭、一抗孵育和二抗孵育等处理后，用DAPI和DAB显色液进行显色，在显微镜下观察并拍照.
-
蚁蚕粗提物对BmLP1降解实验的反应体系如下：BmLP1的对照组中只加入了BmLP1蛋白，最终体积用缓冲液补足；蚁蚕粗提物组中只加入了蚁蚕粗提物，最终体积用缓冲液补足；BmLP1与蚁蚕粗提物孵育的实验组中加入了蚁蚕粗提物与BmLP1，其质量比为3∶1. 缓冲液为100 mmol/L的Tris-HCl，pH值为8.8. 对照组与实验组都在37 ℃下孵育2 h，保证蚁蚕粗提物中的酶与BmLP1充分反应. 反应结束后，取相同体积的量进行SDS-PAGE电泳检测降解效果.
1.1. 材料与试剂
1.2. 氨基酸多序列比对分析
1.3. 30K蛋白基因的RT-PCR检测
1.4. 30K蛋白的SDS-PAGE及Western blotting分析
1.5. 免疫组织化学定位分析
1.6. 蚁蚕粗提物对BmLP1的降解
-
已有研究表明，家蚕的典型30K蛋白在进化树上可以分为4群：Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ和Ⅳ[8]. 其中，Ⅲ群和Ⅳ群在5龄家蚕血液中含量非常高. BmLP1与BmLP2属于典型30K蛋白Ⅲ群，而BmLP3和BmLP7属于典型30K蛋白Ⅳ群. 从silkDB网站下载的BmLP1，BmLP2，BmLP3和BmLP7的氨基酸序列可以看出，它们都有信号肽，因而都属于分泌性蛋白. 将其序列进行比对，发现BmLP3和BmLP7的序列相似性超过90%，BmLP1与另外3个30K蛋白的序列同源性不到50%(图 1).
-
已有的研究揭示了典型30K蛋白基因是在脂肪体中合成的[8-9]，为了检测Bmlp1基因在脂肪体中的表达趋势，提取了不同阶段的脂肪体RNA，将其反转录为cDNA，作为后续检测的模板. 半定量RT-PCR结果表明，Bmactin3在各时期的脂肪体中表达量相当，可以用于下一步目的基因的检测. Bmlp1在家蚕5龄期和蛹前期表达量较高，在蛹后期时，表达量开始降低，这与Bmlp3和Bmlp7的表达特征相似(图 2).
-
为了在蛋白水平上检测BmLP1的含量表达情况，利用制备的BmLP1抗体进行后续实验. 30K蛋白是一群序列结构非常相似的家族，为了检测BmLP1抗体的特异性，用已获得的原核表达蛋白进行检测. 如图 3a所示，对BmLP1，BmLP2，BmLP3和BmLP7的重组蛋白进行凝胶电泳，发现BmLP1和BmLP2的分子量比BmLP3和BmLP7略小. 利用BmLP1抗体与这4种蛋白进行孵育，发现BmLP1抗体只能识别BmLP1蛋白，表明BmLP1抗体特异性较好.
-
由于脂肪体合成的分泌性蛋白会进入到血淋巴中，为了探究BmLP1蛋白在不同时期血淋巴中的变化情况，利用BmLP1抗体进行了检测，结果如图 4所示. 由图 4可知，BmLP1蛋白在5龄期和蛹前期的家蚕血液中高量存在，而在蛾期血液中含量较少，这与脂肪体中的mRNA合成情况相似，表明BmLP1是由脂肪体合成后分泌入血液中的. 蛹后期血淋巴中的BmLP1逐渐减少，而卵巢中的BmLP1却逐渐增多，在蛾期的卵巢中含量达到最高. 而30K蛋白基因在蛹后期和蛾期的卵巢中根本不表达，这表明卵巢中的30K蛋白并非卵巢本身合成，而是由血液转运而来[9].
-
BmLP1蛋白从血液转运进卵巢后，一直储存在卵巢的未受精卵中，当家蚕产下卵时，BmLP1仍然存在于卵中. 为了了解BmLP1蛋白在胚胎发育过程中的变化情况，我们对第6 d和第10 d的受精卵进行了免疫组织化学定位分析，结果如图 5所示. 在卵第6 d时，胚子的雏形可见，发现BmLP1定位于胚子外边的卵黄颗粒中. 当胚胎发育至第10 d，即快孵化时，能明显地看到胚子的形态，此时，BmLP1定位于胚子的肠道内. 这表明，BmLP1最开始定位于胚外的卵黄颗粒中，但快孵化时，BmLP1被胚子吞入进了肠道内，为胚胎的孵化提供氨基酸或能量.
-
在胚胎发育后期，BmLP1被吞入肠腔内，猜测肠腔内有蛋白酶可以降解BmLP1，最终降解的BmLP1可以为胚胎发育提供能量或氨基酸. 为了验证这一猜测，提取蚁蚕的粗提物，将蚁蚕粗提物与BmLP1进行孵育，结果如图 6所示，蚁蚕粗提物可以将BmLP1水解.
2.1. BmLP1与其他30K蛋白的相似性分析
2.2. Bmlp1在脂肪体中的表达特征分析
2.3. BmLP1抗体的特异性检测
2.4. BmLP1在血液和卵巢中的表达情况
2.5. BmLP1在胚胎时期的定位分析
2.6. BmLP1可以被蚁蚕粗提物降解
-
在家蚕的末龄幼虫中，血液重量一般占体质量的1/4[18]. 在5龄期幼虫的血液中，30K蛋白是含量最大的一群蛋白质之一[4-5, 9]. 在其他鳞翅目昆虫，如烟草天蛾、蓖麻蚕、琥珀蚕和印度柞蚕中也鉴定到了30K蛋白的同源基因[8]，但这些物种的血液中30K蛋白的表达量并不高.
本研究选取了在家蚕5龄第7 d血液中含量最高的典型30K蛋白BmLP1进行研究，发现Bmlp1基因在脂肪体中高量表达，表明BmLP1和其他典型30K蛋白均在脂肪体中合成[19]. 由于Bmlp1编码的蛋白质具有信号肽，是一种可分泌蛋白，在脂肪体中表达的Bmlp1基因分泌进入血液中，因此，在5龄期和蛹前期，血液中BmLP1蛋白含量都较高. 但在蛹后期和蛾期，BmLP1蛋白逐渐减少，与此同时，卵巢中的BmLP1却开始增加. 卵巢从蛹期开始急剧生长，卵巢管冲破卵巢膜，游离于体腔中. 卵在卵巢管中形成，并从血液中摄取营养以支持其在蛹期的快速生长. BmLP1被卵巢从血液中吸收并积累到卵中，作为重要的营养物质. 这些转运进卵巢的BmLP1在胚胎发育过程中一直不被利用，直到胚胎后期才开始减少. XU等[21]的研究表明BmLP1是通过BmVgR转运进卵巢的. 免疫组织化学定位分析结果表明，BmLP1蛋白一直储存在卵黄颗粒中，当胚子发育成熟后，胚子将含有BmLP1的卵黄颗粒吞入肠道内. 蚁蚕粗提物孵育实验结果表明，蚁蚕肠道内存在可以降解BmLP1的蛋白酶，最终将BmLP1降解为氨基酸. 这些结果与之前报道的BmLP3和BmLP7的结果相似[8]，暗示了典型30K蛋白的共同特性：合成于脂肪体，分泌入血液，转运进卵巢，贮存在卵中，在蚁蚕孵化前被降解掉.
孵育实验结果表明，蚁蚕粗提物可以将大部分BmLP1水解. 2016年，WANG等[15]从家蚕的5龄幼虫肠液中纯化到一种碱性丝氨酸蛋白酶P-IIc，该蛋白酶最适pH值为11，最适温度为25 ℃. 碱性丝氨酸蛋白酶P-IIc是一个广谱性蛋白酶，可以水解大部分桑叶蛋白质. 另外，该蛋白酶在胚胎后期具有很高的表达量，可以水解卵黄磷蛋白、ESP蛋白和30K蛋白. 值得注意的是，该蛋白酶可以水解大部分BmLP1蛋白，只能部分水解BmLP2、BmLP3、BmLP7和BmLP8[15]，表明其对不同底物的活性不同. 因此，认为家蚕胚胎后期，肠中的丝氨酸蛋白酶P-IIc是导致30K蛋白BmLP1降解的主要水解酶.
-
本研究发现30K蛋白Bmlp1基因在5龄幼虫和蛹期的脂肪体中高量表达，分泌进入血液中. 随着蛹期卵巢管的萌发，BmLP1逐渐从血液转运进卵巢. BmLP1蛋白一直储存在卵巢管的卵中，最终定位于卵黄颗粒中储存. 当胚子发育成熟后，胚子将含有BmLP1的卵黄颗粒吞入肠道内. 肠道内存在可以降解BmLP1的蛋白酶，最终将BmLP1降解为氨基酸，为胚胎的发育提供营养.