Analysis the Volatile Components of Walnut Male Flower (Juglans sigillata) Based on HS-SPME-GC-MS

2020年4月中旬在贵州省核桃研究所良种基地选择3株健壮且正常开花、树龄10年的核桃树单株为对象，在晴朗日下午14：30从每株核桃树上、中、下3个部位的阴阳面分别采集大小相同、无病虫害、形态完整的盛花期核桃雄花穗3朵，经贵州省核桃研究所孙建昌研究员鉴定为泡核桃雄花穗(Juglans sigillata)；样品采集后立即用液氮速冻，置于超低温冰箱(-80 ℃)待测。

无水乙醇和氯化钠(色谱纯)，国药集团化学试剂有限公司；HP6890/5975C GC/MS联用仪，美国安捷伦公司。

按照Lauriezo等^[11]方法对核桃雄花进行HS-SPME-GC-MS分析。精确称取1.5 g混匀核桃雄花鲜样置于25 mL的顶空进样瓶中。将DVB/CAR/PDMS型萃取头于250 ℃条件下进行20 min活化后，在60 ℃平板加热下进行60 min顶空萃取，将萃取头置于GC进样口中进行3 min解吸。

GC-MS条件：AgilentHP-5MS毛细管色谱柱(60 m×0.25 mm，0.25 μm)；升温程序：初始温度40 ℃维持2 min，然后以3.5 ℃/min升温至180 ℃，再以10 ℃/min升温至310 ℃，维持60 min。设置1.0 mL/min为载气(He)流速，且不分流^[12]。

电子电离源(EI)；设置280 ℃为接口温度、150 ℃为四极杆温度、230 ℃为离子源温度；70 eV为电子能量；29~500 m/z为质量扫描范围。

定性分析：挥发性化合物峰的检测和峰对齐以及峰矫正借助Mzmine2完成，解卷积通过AMDIS完成，自动峰识别借助Agilent ChemStation软件完成。挥发性化合物的峰通过AMDIS和ChemStation完成识别后再进行NIST14比对，数据处理过程中以正向匹配大于800和反向匹配大于700为目标进行挥发性化合物的峰过滤和保留，将峰宽上下5%时间窗口内的经两种方法辨别和鉴定一致的化合物筛选出来，再通过RI(保留指数法)对软件鉴定结果进行2次筛选。挥发性化合物的定性以人工谱图解析以及标样质谱图比对相结合的方式进行鉴定^[12]。

定量分析：保留时间的校正采用正构烷烃的实际测量值，以NIST 17数据库对HS-SPME-GC-MS测定的结果进行检索，通过峰面积归一化法对挥发性成分匹配度在80%以上的化学成分进行相对体积分数测定^[13]。

试验进行3次，结果以x ± s表示。采用SPSS 19.0对降维因子进行主成分分析。

由图 1至图 3和表 1可知，采用HS-SPME-GC-MS从核桃雄花中共鉴定出22种挥发性成分，其中醇类物质3种、醛类物质5种、酮类物质和酯类物质各1种、烯烃类物质10种、其他类物质2种。核桃雄花中主要的风味化合物是醇类化合物，具有植物香气，阈值通常较高，阈值偏低的是不饱和醇；碳链越长，其香气越浓郁^[12]。醇类对雄花香气贡献占比为19.03%±1.91%，乙醇浓度最高，为17.52%±1.78%，芳樟醇和反松香芹醇浓度较低，分别为1.25%±0.09%和0.26%±0.04%，在辣椒和花椒以及姜等香辛料中是较为常见的风味物质，主要突出花香气味^[14]。

核桃雄花中的醛类化合物气味浓烈，不同碳位数的醛类化合物其气味大不相同。一般而言，低碳位数醛类刺激性气味较为突出、中碳位数醛类具有油脂味、高碳位数醛类具有柑橘皮的香味^[15]。醛类化合物对雄花香气贡献占比为6.43%±1.11%，除乙醛外，另外4种主要醛类的碳原子为4~9个，是直链醛，主要贡献清香和坚果香以及脂香^[16]。乙醛、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛的相对体积分数较高，分别为1.50%±0.12%、1.03%±0.10%、2.85%±0.77%。壬醛主要来自油酸氧化，具有脂肪、柑橘和青草的味道。

不饱和脂肪酸因受热而发生热氧化反应、不饱和脂肪酸降解、氨基酸降解等因素均会产生酮类化合物^[16-17]。具有甜的花香、果香特征的酮类化合物只占一部分，随碳链增加，呈现出强烈的花香特征^[18]。核桃雄花中仅检测出1种酮类，为松油酮，相对体积分数较低。酯质因发生氧化产生醇和游离脂肪酸，是产生酯类化合物的主要途径，一般具有水果香气、有甜味^[18]，在核桃雄花中仅检测出1种酯类化合物，为十六烷酸乙酯。

烯烃类是因脂肪酸烷氧自由基发生均裂而产生的一类感知阈值较高的化合物，在气味贡献方面作用不大^[18]，然而个别烯烃类对雄花气味的贡献作用突出^[19]。香辛料中如花椒、橘皮、辣椒以及八角、茴香中烯烃类物质种类较为丰富^[20]，其中α-蒎烯、β-蒎烯、柠檬烯赋予松脂味、柑橘味、薄荷甜味^[21]。核桃雄花中烯烃类化合物相对体积分数为10.32%±1.84%，其中α-蒎烯、β-蒎烯、石竹烯、Δ-杜松烯相对体积分数较高，分别为1.36%±0.24%、1.56%±0.35%、2.70%±0.87%、2.57%±0.13%。

核桃雄花中也产生含硫类物质和其他物质，胡桃醌和二甲硫醚在挥发性成分中占比为62.18%±2.93%。雄花中含硫类物质一般感知阈值较低，但气味较强。大蒜和韭菜以及洋葱等刺激性气味在含硫类物质中较为常见^[21]。

由图 4可以看出，22种挥发性成分中以胡桃醌、乙醇、3-甲基丁醛、石竹烯、Δ-杜松烯5种挥发性化合物方向的雷达线较为突出，说明这5种挥发性化合物的体积分数在核桃雄花众多化合物中占比较高，分别为61.82%±2.89%、17.52%±1.78%、2.85%±0.77%、2.70%±0.87%、2.57%±0.13%。

为规避各变量之间可能存在的错综复杂的关系，采用因子分析法对核桃雄花中挥发性成分进行分析，公因子提取方法采用主成分分析法。由表 2可知，特征值大于1的主成分有2个，这2个主成分的累积方差贡献率达到100%，可见核桃雄花中主要挥发性成分可以用PC₁、PC₂两个主成分来表示。PC₁、PC₂涵盖了原始变量中的绝大部分信息，降维目的得以达到^[22-23]。碎石图可以进一步反应主成分的筛选，由图 5可知，前2个点连成的曲线坡度较陡，曲线斜率相对较大，从第2个点至3个点以后连成的曲线走势较为平缓，曲线坡度远不如前者，而且曲线的斜率相对较小。碎石图说明当某个特征根较前一特征根的值出现较大下降、而这个特征根较小、其后面的特征根变化不大时，说明添加相应于该特征根的因素只能增加很少的信息，所以前几个特征根就是应抽取的公共因素。

各变量和主成分之间的相关系数在载荷值上得以体现，各变量与主成分的正/负相关采用+/-表示，指标与主成分关联程度用载荷值的绝对值呈现，映射主成分上指标的载荷程度^[24]。由表 3可以看出，全部测定成分都能够被两个主成分较好地解释。因子对应特征值开平方根后的值被各指标变量的主成分载荷相除，即为各指标所对应特征向量系数，其中第1个主成分PC₁=0.04 X₁-0.22 X₂+0.23 X₃+0.22 X₄-0.23 X₅-0.20 X₆-0.23 X₇-0.23 X₈+0.23 X₉+0.23 X₁₀+0.23 X₁₁+0.23 X₁₂+ 0.20 X₁₃-0.23 X₁₄-0.19 X₁₅+0.22 X₁₆+0.22 X₁₇+0.21 X₁₈-0.23 X₁₉-0.13 X₂₀+0.23 X₂₁+0.22 X₂₂；第2主成分PC₂=0.57 X₁+0.13 X₂+0.17 X₄-0.07 X₅-0.27 X₆-0.03 X₇-0.09 X₈-0.06 X₉+0.04 X₁₁-0.01 X₁₂-0.29 X₁₃+0.06 X₁₄+0.34 X₁₅+0.19 X₁₆-0.14 X₁₇+0.21 X₁₈+0.09 X₁₉+0.47 X₂₀+0.04 X₂₁+0.11 X₂₂。

由图 6可知，22种挥发性风味化合物分布在4个象限，X₁、X₄、X₁₀、X₁₁、X₁₂、X₁₆、X₁₈、X₂₁、X₂₂分布在第1象限，以乙醇、乙醛、酯类、烯烃类及其他化合物为主。X₂、X₁₄、X₁₅、X₁₉、X₂₀分布在第2象限，以芳樟醇、烯烃类化合物为主。X₅、X₆、X₇、X₈分布在第3象限，以醛类化合物为主。X₃、X₉、X₁₃、X₁₇分布在第4象限，以反松香芹醇、松油酮及烯烃类化合物为主。X₄、X₁₀、X₁₁、X₁₂、X₁₆、X₁₈、X₂₁、X₂₂、X₃、X₉、X₁₃、X₁₇、X₂、X₅、X₆、X₇、X₈、X₁₄、X₁₉在PC₁上贡献较高，PC₁与这19种挥发性成分相关性较强，在气味上主要以松木、针叶、松树味、松脂味、松节油味、柑橘、薄荷为主，附带有辛辣味^[21]。X₁、X₁₅、X₂₀在PC₂上贡献较高，PC₂与这3种挥发性成分相关性较强，在气味上主要以柑橘、樟脑味为主，附带辛辣^[21]。

植物在生长发育过程中所释放的挥发性成分除受自身发育阶段的影响外，还受制于外部环境因子^[25]，其变化调控着花香化合物的种类多少、化合物的含量高低。本研究选择晴天进行采样以规避外部环境因子对核桃雄花挥发性成分的影响，发现烯烃类在核桃雄花挥发性成分中种类最多，酮类与酯类最少。在核桃雄花挥发性成分中相对体积分数较高的是醇类、醛类、烯烃类和其他化合物，较低的是酮类和酯类化合物，这与部分研究得出的结论一致^[8]。本研究中体积分数较高的其他芳香族化合物，主要贡献脂香气味，醇类主要呈现花香气味，烯烃类赋予薄荷、松脂及柑橘味，醛类主要贡献清香、坚果香味。本研究通过HS-SPME-GC-MS技术从核桃雄花穗中鉴定出22种化合物，而杨犇^[8]从核桃花絮中鉴定出34种化合物，究其原因可能与样品种类以及处理方式不同有关。本研究是将核桃雄花穗鲜样用液氮加以研磨后称取一定质量置于顶空进样瓶中进行分析，杨犇^[8]是将干制的核桃花絮进行处理提取挥发油后再进行挥发性成分解析，核桃花絮经过长时间浸泡和乙醚的多次萃取可使其挥发性成分的种类及体积分数得到富集。李桂香等^[7]利用气相色谱和质谱联用从核桃花中鉴定出29种挥发性成分，与本研究得到的试验结果有一定出入。在样品处理方面，李桂香等^[7]是将核桃花阴干后粉碎再加入乙酸乙酯进行超声处理，而后用0.22 μm滤膜对滤液进行过滤和上机分析，乙酸乙酯能更好地将脂溶性成分溶解出来，加之超声处理能破坏植物细胞壁，更有利于细胞内部成分的释放。在品种方面，李桂香等^[7]采用的是核桃(Juglans regia L.)的花序，而本研究的样品为泡核桃雄花穗(Juglans sigillata)。此外，本研究与李桂香等^[7]的研究结果发现了共有的挥发性成分，共计7种，分别为反松香芹醇、壬醛、α-蒎烯、β-蒎烯、石竹烯、芳姜黄烯、Δ-杜松烯。

本研究与卓志航等^[26]从核桃树皮中鉴定出的共有成分有α-蒎烯、β-蒎烯、石竹烯、胡桃醌，其中α-蒎烯、胡桃醌的相对体积分数是其结果的6.77倍、8.79倍；从核桃叶中鉴定出的共有成分有芳樟醇、壬醛、α-蒎烯、β-蒎烯、石竹烯、Δ-杜松烯、胡桃醌，其中壬醛、Δ-杜松烯、胡桃醌的相对体积分数是其结果的6.55倍、2.65倍、10.04倍，说明核桃雄花较之核桃树皮和核桃叶更易发生褐变。李寅珊等^[27]利用气相色谱和质谱联用从漾濞泡核桃壳中鉴定出20种挥发性成分，与本研究共有的挥发性成分为柠檬烯(1.56%)，而本研究中柠檬烯的体积分数为0.30%，是本研究的5.2倍。王宏歌等^[28]以核桃楸外果皮为研究对象，利用GC-MS分析其挥发性成分，从中共鉴定出45种挥发性成分，与本研究共有的挥发性成分为石竹烯(0.92%)和Δ-杜松烯(2.37%)。本研究中石竹烯和Δ-杜松烯的相对体积分数分别为2.70%、2.57%，是其研究结果的2.93倍、1.08倍；毛祥忠等^[29]采用同步蒸馏萃取法、气质联用仪相结合技术对健康的核桃树皮以及核桃树叶的挥发性成分进行了测定，均鉴定出35种化合物，本研究与其鉴定出的共有挥发性成分共5种，分别为壬醛(0.57%)、石竹烯(8.93%)、α-蒎烯(1.36%)、β-蒎烯(6.89%)、Δ-杜松烯(4.90%)。本研究中5种成分的相对体积分数分别为0.72%、2.70%、1.36%、1.56%、2.57%，壬醛的相对体积分数是其结果的1.26倍，α-蒎烯的相对体积分数与其研究结果基本一致，石竹烯、β-蒎烯、Δ-杜松烯的相对体积分数均高于本研究。综上可知，相同的核桃品种同一器官中的挥发性成分种类和体积分数也存在差异，这与处理方法、地域、所处的海拔高度及物候因素有很大关系。此外，不同的核桃品种不同器官中的挥发性成分种类和体积分数也是不同的，说明植物中的挥发性成分具有明显的品种及器官特异性。

本研究的结果表明，核桃雄花穗中胡桃醌的体积分数较高，而卓志航等^[26]从核桃树皮和核桃叶中鉴定出来的胡桃醌的体积分数均低于本研究，说明胡桃醌具有明显的器官差异性。经查阅文献资料发现胡桃醌具有抗菌作用和化感作用，因此利用核桃雄花穗提取胡桃醌研发制成抗菌剂和植物除草剂具有一定的市场前景。此外，核桃雄花穗落地或采摘以后极易褐变，这可能和其高体积分数的胡桃醌密切相关。据文献报道，胡桃醌结构中存在1个酚羟基，属于酚类化合物，这进一步说明了核桃雄花穗采摘后易于发生褐变的原因^[30-31]。

贵州产区泡核桃雄花香气主要由醇类、醛类、酮类、酯类、烯烃类和其他成分构成，醇类、醛类、酯类和烯烃类化合物贡献了突出的水果类气味，烯烃类化合物是泡核桃雄花香气的重要贡献成分，可将其纳入后续评价其香气质量的重要指标。后续研究可结合非靶或者靶向对核桃雄花中的成分做进一步的探索，或开展同一核桃单株上不同器官间的挥发性成分的差异研究等。