Identification of Phenotype and Analysis of Candidate Gene of Rice Small Grain Mutant <i>smg5</i>

PENG Hanping; ZHENG Xinyuan; LIU Jianyao; LIU Moyan; ZHU Honghui; LI Yingzi; LEI Liangzhe; CAO Chen; ZHANG Ting; LI Yunfeng; ZHUANG Hui

doi:10.13718/j.cnki.xdzk.2025.07.003

2025 Volume 47 Issue 7

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PENG Hanping, ZHENG Xinyuan, LIU Jianyao, et al. Identification of Phenotype and Analysis of Candidate Gene of Rice Small Grain Mutant smg5[J]. Journal of Southwest University Natural Science Edition, 2025, 47(7): 33-46. doi: 10.13718/j.cnki.xdzk.2025.07.003

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PENG Hanping, ZHENG Xinyuan, LIU Jianyao, et al. Identification of Phenotype and Analysis of Candidate Gene of Rice Small Grain Mutant smg5[J]. Journal of Southwest University Natural Science Edition, 2025, 47(7): 33-46. doi: 10.13718/j.cnki.xdzk.2025.07.003

Identification of Phenotype and Analysis of Candidate Gene of Rice Small Grain Mutant smg5

1.
Rice Research Institute, Southwest University/Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Application and Safety Control of Genetically Modified Crops, Chongqing 400715, China
2.
Yibin Academy of Southwest University, Yibin Sichuan 644000, China

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Corresponding author: ZHUANG Hui
Received Date: 11/02/2025
Available Online: 20/07/2025
MSC: S511

Abstract

Rice yield is mainly determined by effective panicle number per unit area, grains per panicle and grain weight, in which grain weight is mainly influenced by grain size. Identifying and cloning the new genes regulating grain size is of great significance for improving the regulation mechanism of grain size and increasing rice yield. This study reported a small grain mutant named small grain 5 (smg5) identified from the mutagenesis population of an indica rice maintainer line Xida1B (XD1B) induced by ethyl methane sulfonate (EMS). Compared with the wild type, smg5 mutant exhibited significantly smaller grains along with dwarf plant and erect panicles. Histocytological analysis showed that the small grain phenotype of smg5 mutant was related to the abnormal expansion and proliferation of the glume cells, which led to decreased cell number and size. Genetic analysis showed that the trait of smg5 mutant was controlled by a pair of recessive single gene. SMG5 was mapped to a region of 27.5-29.2 Mb on chromosome 7 by MutMap. Moreover, re-sequencing and PCR sequencing identified a C-T single base substitution at the 37^th base of the fifth exon of LOC_Os07g47950 from the mutant, resulting in an amino acid change from threonine (Thr) to isoleucine (Ile). The mutation rate of this SNP in the mutant and wild phenotype plants of the F2 population was 100% and 15%, respectively. Therefore, the LOC_Os07g47950 was tentatively identified as the candidate gene of SMG5.
- rice (Oryza sativa L.),
- small grain mutant,
- phenotype identification,
- gene mapping

References

[1]	LI N, XU R, DUAN P, et al. Control of Grain Size in Rice[J]. Plant Reprod, 2018, 31(3): 237-251. Google Scholar
[2]	LI N, XU R, LI Y H. Molecular Networks of Seed Size Control in Plants[J]. Annual Review of Plant Biology, 2019, 70: 435-463. Google Scholar
[3]	李堂, 曹华盛, 熊亮, 等. 水稻粒型调控基因功能研究进展[J]. 广东农业科学, 2023, 50(12): 12-28. Google Scholar
[4]	SONG X J, HUANG W, SHI M, et al. A QTL for Rice Grain Width and Weight Encodes a Previously Unknown RING-Type E3 Ubiquitin Ligase[J]. Nature Genetics, 2007, 39(5): 623-630. Google Scholar
[5]	ASHIKARI M, WU J, YANO M, et al. Rice Gibberellin-insensitive Dwarf Mutant Gene Dwarf 1 Encodes the Alpha-Subunit of GTP-binding Protein[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1999, 96(18): 10284-10289. Google Scholar
[6]	WANG L, XU Y Y, MA Q B, et al. Heterotrimeric G Protein Alpha Subunit is Involved in Rice Brassinosteroid Response[J]. Cell Research, 2006, 16(12): 916-922. Google Scholar
[7]	UTSUNOMIYA Y, SAMEJIMA C, TAKAYANAGI Y, et al. Suppression of the Rice Heterotrimeric Gprotein B-subunit Gene, RGB1, Causes Dwarfism and Browning of Internodes and Lamina Joint Regions[J]. The Plant Journal, 2011, 67(5): 907-916. Google Scholar
[8]	HONG Z, UEGUCHI-TANAKA M, UMEMURA K, et al. A Rice Brassinosteroid-Deficient Mutant, Ebisu Dwarf (D2), is Caused by a Loss of Function of a New Member of Cytochrome P450[J]. The Plant Cell, 2003, 15(12): 2900-2910. Google Scholar
[9]	TANABE S, ASHIKARI M, FUJIOKA S, et al. A Novel Cytochrome P450 is Implicated in Brassinosteroid Biosynthesis via the Characterization of a Rice Dwarf Mutant, Dwarf11, with Reduced Seed Length[J]. The Plant Cell, 2005, 17(3): 776-790. Google Scholar
[10]	SHI Z Y, RAO Y C, XU J, et al. Characterization and Cloning of SMALL GRAIN 4, a Novel DWARF11 Allele that Affects Brassinosteroid Biosynthesis in Rice[J]. Science Bulletin, 2015, 60(10): 905-915. Google Scholar
[11]	LIU L C, TONG H N, XIAO Y H, et al. Activation of Big Grain1 Significantly Improves Grain Size by Regulating Auxin Transport in Rice[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2015, 112(35): 11102-11107. Google Scholar
[12]	朱洪慧, 李映姿, 高远卓, 等. 水稻短宽粒基因SWG1的图位克隆[J]. 中国农业科学, 2023, 56(7): 1260-1274. Google Scholar
[13]	WANG S K, WU K, YUAN Q B, et al. Control of Grain Size, Shape and Quality by OsSPL16 in Rice[J]. Nature Genetics, 2012, 44(8): 950-954. Google Scholar
[14]	WANG S K, LI S, LIU Q, et al. The OsSPL16-GW7 Regulatory Module Determines Grain Shape and Simultaneously Improves Rice Yield and Grain Quality[J]. Nature Genetics, 2015, 47(8): 949-954. Google Scholar
[15]	WANG Y X, XIONG G S, HU J, et al. Copy Number Variation at the GL7 Locus Contributes to Grain Size Diversity in Rice[J]. Nature Genetics, 2015, 47(8): 944-948. Google Scholar
[16]	ANDREASSON E, ELLIS B. Convergence and Specificity in the Arabidopsis MAPK Nexus[J]. Trends in Plant Science, 2010, 15(2): 106-113. Google Scholar
[17]	ZHANG M M, ZHANG S Q. Mitogen-activated Protein Kinase Cascades in Plant Signaling[J]. Journal of Integrative Plant Biology, 2022, 64(2): 301-341. Google Scholar
[18]	WIDMANN C, GIBSON S, JARPE M B, et al. Mitogen-activated Protein Kinase: Conservation of a Three-Kinase Module from Yeast to Human[J]. Physiological Reviews, 1999, 79(1): 143-180. Google Scholar
[19]	YANG K Y, LIU Y, ZHANG S. Activation of a Mitogen-activated Protein Kinase Pathway Is Involved in Disease Resistance in Tobacco[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2001, 98(2): 741-746. Google Scholar
[20]	SEGER R, KREBS E G. The MAPK Signaling Cascade[J]. FASEB Journal, 1995, 9(9): 726-735. Google Scholar
[21]	XU R, DUAN P G, YU H Y, et al. Control of Grain Size and Weight by the OsMKKK10-OsMKK4-OsMAPK6 Signaling Pathway in Rice[J]. Molecular Plant, 2018, 11(6): 860-873. Google Scholar
[22]	GUO T, CHEN K, DONG N Q, et al. GRAIN SIZE AND NUMBER1 Negatively Regulates the OsMKKK10-OsMKK4-OsMPK6 Cascade to Coordinate the Trade-off between Grain Number Per Panicle and Grain Size in Rice[J]. The Plant Cell, 2018, 30(4): 871-888. Google Scholar
[23]	CHUJO T, MIYAMOTO K, OGAWA S, et al. Overexpression of Phosphomimic Mutated OsWRKY53 Leads to Enhanced Blast Resistance in Rice[J]. PLoS One, 2014, 9(6): e98737. Google Scholar
[24]	HU L F, YE M, LI R, et al. The Rice Transcription Factor WRKY53 Suppresses Herbivore-Induced Defenses by Acting as a Negative Feedback Modulator of Mitogen-activated Protein Kinase Activity[J]. Plant Physiology, 2015, 169(4): 2907-2921. Google Scholar
[25]	SUGIHARA Y, YOUNG L, YAEGASHI H, et al. High-performance Pipeline for MutMap and QTL-Seq[J]. PeerJ, 2022, 10: e13170. Google Scholar
[26]	GUO T, LU Z Q, SHAN J X, et al. ERECTA1 Acts Upstream of the OsMKKK10-OsMKK4-OsMPK6 Cascade to Control Spikelet Number by Regulating Cytokinin Metabolism in RiceFree[J]. The Plant Cell, 2020, 32(9): 2763-2779. Google Scholar
[27]	DUAN P G, RAO Y C, ZENG D L, et al. SMALL GRAIN 1, which Encodes a Mitogen-activated Protein Kinase Kinase 4, Influences Grain Size in Rice[J]. Plant Journal, 2014, 77(4): 547-557. Google Scholar
[28]	LIU S Y, HUA L, DONG S J, et al. OsMAPK6, a Mitogen-Activated Protein Kinase, Influences Rice Grain Size and Biomass Production[J]. The Plant Journal, 2015, 84(4): 672-681. Google Scholar
[29]	FANG N, XU R, HUANG L J, et al. SMALL GRAIN 11 Controls Grain Size, Grain Number and Grain Yield in Rice[J]. Rice, 2016, 9(1): 64. Google Scholar
[30]	ABE A, KOSUGI S, YOSHIDA K, et al. Genome Sequencing Reveals Agronomically Important Loci in Rice Using MutMap[J]. Nature Biotechnology, 2012, 30(2): 174-178. Google Scholar
[31]	MICHELMORE R W, PARAN I, KESSELI R V. Identification of Markers Linked to Disease-resistance Genes by Bulked Segregant Analysis: A Rapid Method to Detect Markers in Specific Genomic Regions by Using Segregating Populations[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1991, 88(21): 9828-9832. Google Scholar
[32]	王涛. 一个水稻粒型相关基因的克隆与功能研究[D]. 雅安: 四川农业大学, 2018. Google Scholar
[33]	FIIL B K, PETERSEN K, PETERSEN M, et al. Gene Regulation by MAP Kinase Cascades[J]. Current Opinion in Plant Biology, 2009, 12(5): 615-621. Google Scholar

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通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com

1.
沈阳化工大学材料科学与工程学院沈阳 110142

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随着全球人口的持续增长，粮食需求日益增加，水稻作为主要粮食作物之一，其产量直接关系到国家的粮食安全。粮食安全不仅是国家发展的基本保障，也是社会稳定的重要基础，因此，提高水稻产量成为水稻育种的核心目标之一。水稻产量主要由单位面积有效穗数、每穗粒数和粒质量3个因素决定，其中粒质量主要受到籽粒形态和灌浆程度的影响。水稻籽粒具有谷类作物种子的典型特征，其内部的胚和胚乳被一层薄种皮包裹，储存灌浆期积累的淀粉和其他营养物质，占据成熟种子的大部分。籽粒外层由内颖和外颖组成的颖壳包裹，在发育早期，颖壳细胞快速分裂以增加细胞数量；而后细胞分裂逐渐减慢，细胞开始扩展以增大面积；最终颖壳不同维度的细胞数目和细胞大小决定了籽粒长度、宽度和厚度，从而限制灌浆充实的程度。因此，籽粒形态主要由颖壳细胞增殖和细胞扩展调节，是与水稻产量密切相关的重要农艺性状^[1-2]。

近年来，分子生物学和基因组学的发展为探究水稻粒型的调控机制带来了新的变革。大量调控水稻粒型的数量性状遗传位点(QTL)以及相关基因被成功鉴定与解析^[3]，其中多数基因通过调控颖壳细胞的增殖或/和扩展来影响水稻粒型，其功能也在随后研究中得到验证。目前，已有多条水稻粒型调控途径被鉴定，如泛素—蛋白酶体降解途径、G蛋白信号途径、植物激素途径以及转录因子调控途径等。这些调控途径的关键基因在水稻籽粒发育进程中担当重要角色，如GRAIN WIDTH 2(GW2)位于泛素—蛋白酶体降解途径，其编码一个RING-like E3泛素连接酶，通过降解其锚定到蛋白酶体的底物负调节细胞分裂。GW2的功能缺失突变体颖壳细胞数目增加，粒宽和粒质量增加^[4]。RICE HETEROTRIMERIC G-PROTEIN ALPHA SUBUNIT 1(RGA1)和RICE HETEROTRIMERIC G-PROTEIN BETA SUBUNIT 1(RGB1)基因位于G蛋白信号途径，分别编码G蛋白复合体中的Gα亚基和Gβ亚基，通过正向调控细胞增殖来影响籽粒大小，其功能缺失突变体表现为籽粒变小^[5-7]。DWARF 2(D2)和DWARF 11(D11) 位于油菜素内酯(BR)信号途径，编码细胞色素P450家族蛋白，通过正向调控颖壳细胞扩展影响籽粒大小^[8-10]。BIG GRAIN 1(BG1)位于生长素(Auxin)信号途径，编码一个膜定位蛋白，通过正向调控颖壳细胞增殖和扩展影响籽粒大小^[11]。SHORT AND WIDEN GRAIN 1(SWG1)编码一个转录因子，通过正向调控细胞扩展影响籽粒长度，同时可负向调控横向细胞增殖与扩展影响籽粒宽度，从而在不同方向上呈现出相反的调控效应^[12]。GRAIN WIDTH 8(GW8)编码一个包含SBP结构域的转录因子OsSPL16，GW8的高表达可以促进细胞增殖，导致籽粒变宽。GRAIN WIDTH 7(GW7) 编码一个TONNEAU1募集基序蛋白，其表达量上调能增加颖壳纵向细胞分裂并减少横向细胞分裂。GW8能直接与GW7的启动子结合并抑制其表达，最终实现对水稻粒宽的正向调控^[13-15]。

此外，丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联反应也对调控水稻籽粒形态起到了重要作用。MAPK级联反应是真核生物中保守的信号转导机制，由MAPK、MAPK激酶(MKK)和MAPKK激酶(MKKK) 3类激酶通过顺序磷酸化，将外源或发育信号传递至下游靶分子^[16-18]。在典型机制中，MKKK在质膜受体刺激下通过磷酸化MKK的丝氨酸/苏氨酸残基使其激活，随后被激活的MKK双重磷酸化MAPK的T-X-Y保守基序中的苏氨酸和酪氨酸残基，最终通过底物的磷酸化实现信号传递^[19]。研究表明，植物可利用编码的MKKK、MKK和MAPK蛋白组合成数千种MKKK-MKK-MAPK级联反应，进而调节不同生物学过程^[20]。在水稻中OsMKKK10-OsMKK4-OsMAPK6级联反应途径可影响穗部与籽粒形态的发育。SMALL GRAIN 2(SMG2)、SMALL GRAIN 1(SMG1)、DWARF AND SMALL GRAIN1(DSG1) 分别编码OsMKKK10、OsMKK4、OsMAPK6，这3个基因突变均导致植株矮化、穗型直立密集，并因限制颖壳细胞增殖而使籽粒变小。OsMKKK10能与OsMKK4互作并将其磷酸化，OsMKK4继而磷酸化OsMAPK6，形成一条正向调控颖壳细胞增殖的级联反应^[21]。此外，GRAIN SIZE AND NUMBER 1(GSN1) 基因编码一个丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶OsMKP1，可直接与OsMAPK6互作，并通过去磷酸化使后者失活。当GSN1的表达水平降低时，籽粒虽增大但籽粒数减少；反之，表达水平升高使籽粒数增多但籽粒变小。由此可见，GSN1通过负调控OsMKKK10-OsMKK4-OsMAPK6级联途径，在水稻每穗粒数与籽粒大小之间进行平衡^[22]。另外，研究还发现编码WRKY转录因子的OsWRKY53是该级联反应的直接下游靶基因。oswrky53突变体籽粒变小，而超量表达OsWRKY53则使籽粒增大^[23-24]。

综上所述，影响籽粒形态的基因数量庞大，且粒型调控网络相当复杂。部分基因上下游的调控关系及作用机制尚不完善，我们仍需要鉴定并克隆更多基因以完善粒型调控网络。本研究中，我们发现了1个与水稻籽粒发育相关的突变体，其主要表现为细胞增殖与扩展异常导致籽粒变小。遗传分析表明，该突变性状受1个隐性单基因控制，我们将其命名为small grain 5 (smg5)。利用MutMap方法，我们将SMG5的候选基因定位在水稻第7条染色体上27.5~29.2 Mb中。结合重测序和PCR测序结果发现，smg5突变体中LOC_Os07g47950基因第5外显子的第37位发生了C-T单碱基替换，从而导致原本翻译的氨基酸由苏氨酸变为异亮氨酸。LOC_Os07g47950基因编码一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其功能此前未被鉴定。本研究为解析SMG5基因调控籽粒形态发育的分子机制，进而完善水稻粒型调控网络奠定基础。

1. 材料与方法

1.1. 试验材料

本研究中的水稻小籽粒突变体small grain 5 (smg5)来源于西南大学水稻研究所籼稻保持系西大1B(XD1B)的甲基磺酸乙酯(EMS)诱变库，经过多代自交进行分离纯化后，突变体性状得到稳定遗传。本研究中所用到的水稻材料均种植在重庆市歇马实验基地。

1.2. 形态与组织学分析

在野生型和smg5突变体成熟期选取籽粒，用扫描电镜和体视镜进行表型观察并拍照，抽穗期选取未开花的小穗，置于FAA固定液(由50%无水乙醇，0.9 mol/L的冰乙酸和3.7%甲醛混合配制)中，浸泡超过48 h以固定细胞形态。样本依次进行乙醇梯度脱水、二甲苯透明处理、石蜡浸泡和包埋，调整蜡块形状并固定在石蜡切片机上，切出10 μm厚蜡带；用毛笔轻挑蜡带平放于载玻片上，进行预检查和分段后，转移至涂有多聚赖氨酸的载玻片上，分别于展片机和烘箱中(42 ℃)进行展片与烘片；最后进行番红染色，并用中性树脂封片，用光学显微镜(NikonE600)观察制作好的石蜡切片并拍照。

1.3. 统计分析

统计分析于2023年夏季水稻抽穗期与成熟期进行。在农艺性状的统计分析中，随机选取10株野生型和10株突变体，统计穗长、一次枝梗数、二次枝梗数、每穗粒数、结实率、粒长、粒宽和千粒质量等农艺性状。在细胞形态和数目统计分析中，随机选取野生型和突变体成熟期的10个籽粒进行扫描电镜观察，统计颖壳纵向细胞数量与细胞长度；随机选取抽穗期10个小穗进行石蜡切片观察，每张切片统计小穗颖壳横向细胞数量与细胞面积。差异显著性均采用t检验，p＜0.05表示差异有统计学意义。

1.4. 遗传分析

以西大1B和smg5突变体为亲本进行杂交获得F₁代，F₁代自交获得F₂代。观察并统计F₂代群体中野生型表型和突变体表型单株数，计算F₂代群体性状分离比并进行卡方检验。

1.5. 基因定位

基于混合群体分离分析法(Bulked segregant analysis，BSA)，将西大1B和smg5突变体杂交，所获F₂代群体用于目标基因的定位。F₂代群体中出现明显性状分离，在分离群体中选取野生型单株和突变型单株各30株，混取等量叶片分别构建野生型基因池和突变型基因池，将样品送至深圳华大基因股份有限公司进行基因组重测序分析。

将野生型基因池和突变型基因池中的测序结果分别与日本晴参考基因组序列进行比对，运用Sugihara等^[25]在GitHub平台上发布的MutMap v2.3.8软件包筛选SNP。首先，运用Trimmomatic软件处理原始测序获得的reads并去除低质量序列；随后，利用BWA和SAMtools软件进行reads比对和初步变异检测，借助BCFtools软件，依据映射质量不低于26、碱基质量不小于18的标准筛选InDel/SNP，计算InDel/SNP指数，去除突变型基因池中与野生型相同的InDel/SNP；最后，用Mutplot软件绘制InDel/SNP在水稻12条染色体上的滑动窗口分布图，据此确定候选基因的定位区间。选取定位区间内在突变型基因池中SNP指数大于0.9的SNP为候选SNP，利用IGV(Integrative Genomics Viewer)浏览器查看候选SNP在基因组上的位置，结合在国家水稻数据中心(https://www.ricedata.cn/gene/)查询获得的基因注释信息及表达情况进一步筛选候选基因。

1.6. 候选基因分析与克隆

从Gramene网站查询并下载候选基因序列，用Vector NTI 10.5软件设计特异性扩增引物，引物名称LOC_Os07g47950，正向序列(5′-3′)GCAGCAGTGTTGTACTGTTCTTCG，反向序列(5′-3′)GGGAGGGCTTACTCTGTATCAGG，分别以野生型、smg5突变体以及F₂群体中正常表型植株和突变表型植株的DNA为模板扩增目标序列。PCR总体系为25.0 μL：含10× PCR buffer 12.5 μL，dNTPs 5 mmol/L，ddH₂O 4.4 μL，10 μmol/L的前后引物各0.8 μL，模板DNA 1.0 μL，5 U/μL Taq酶0.5 μL。PCR程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃复性1 min，35个循环；72 ℃延伸5 min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，送至北京擎科生物科技有限公司进行测序分析，利用Vector NTI 10.5软件对测序结果进行序列比对，用Chromas2软件查看测序峰图，确定突变位点并完成候选基因鉴定。

3. 讨论与结论

3.1. 讨论

3.1.1. SMG5通过同时调控颖壳细胞的增殖和扩展影响籽粒形态

水稻籽粒形态主要由颖壳细胞增殖和细胞扩展调节。近年来，已鉴定到许多与籽粒发育相关的基因，其中已知多个调控小籽粒形态的基因，他们主要通过单独调控细胞增殖使籽粒变小。例如，SMG2/OsMKKK10正向调控颖壳细胞增殖，smg2突变体外稃纵向细胞和横向细胞的数量均显著低于野生型，致使其粒长和粒宽减少^[26]；SMG1/OsMKK4相应突变体与野生型相比，其颖壳表皮细胞面积差异不显著，但细胞数量显著降低，说明SMG1/OsMKK4主要影响细胞增殖调控粒型^[27]；DSG1/OsMAPK6正向调控籽粒外稃表皮细胞增殖，其突变体粒长与粒宽均降低^[28]。此外，还有基因通过单独调控细胞扩展影响籽粒形态。例如，small grain 1(smg11) 突变体籽粒的颖壳外表皮细胞面积显著减小，但细胞数量与野生型相似，说明SMG11主要影响颖壳细胞扩展正向调控籽粒大小^[29]。目前所鉴定的小籽粒表型相关基因，大多数通过单独影响细胞增殖或细胞扩展调控籽粒形态，但能同时调控细胞增殖和扩展使籽粒变小的基因较为少见。

本研究中，通过组织细胞学分析深入解析了smg5突变体籽粒变小的原因。在纵向上，突变体外稃纵向细胞长度与野生型差异无统计学意义，但纵向细胞总数显著低于野生型，说明SMG5基因通过调控细胞增殖影响籽粒长度；在横向上，突变体籽粒颖壳外稃的细胞数目与野生型相似，但相同部位单个细胞面积显著低于野生型，表明SMG5基因通过影响细胞扩展调控籽粒宽度，因此，SMG5基因能够同时正向调控纵向细胞增殖和横向细胞扩展，从而影响籽粒的形态发育。深入探究其粒型调控机制有益于解析这一特殊的调控方式。

3.1.2. 利用MutMap方法克隆SMG5候选基因

MutMap是Abe等^[30]于2012年提出的一种基因克隆方法。基于BSA法，MutMap结合高通量二代测序技术，通过比对突变型与野生型基因池的测序结果及等位基因频率，降低遗传背景的干扰，准确定位到与目标性状紧密连锁的InDel/SNP突变位点上^[31]。随后，Sugihara等^[25]于2022年在GitHub平台上发布MutMap v2.3.8软件包，在Abe等的基础上优化算法，使测序数据处理速度提升了5~6倍，并可以精确识别出基因池间的InDel/SNP差异。与图位克隆等传统的基因克隆方法相比，MutMap无需构建复杂的遗传群体和遗传图谱。基于全基因组测序数据，使得该方法能够更全面、准确、迅速地锁定目标基因。MutMap方法综合运用了全基因组学、生物信息学和分子遗传学等多学科技术，在不断实践与优化中成为一种成熟的基因克隆方法，为水稻等作物的育种研究提供了丰富的基因资源。

MutMap方法现已被广泛应用于克隆水稻的各项产量性状基因，并在籽粒发育相关基因研究中展现出较大潜力，如调控小籽粒形态的基因SMG2/OsMKKK10、SMG11/D2等，均通过MutMap方法进行了克隆。SMG2/OsMKKK10编码蛋白激酶参与MAPK途径调控籽粒形态^[26]，SMG11/D2编码细胞色素P450参与BR植物激素途径影响籽粒形态^[29]。此外，王涛^[32]运用MutMap方法克隆到长籽粒基因GRAIN LENGTH 5(GL5)，其编码一个酪氨酸磷酸酶蛋白。GL5可与MAPK6互作，参与协调MAPK级联反应调控粒型，因此MutMap对于鉴定水稻粒型新基因有重要意义。

本研究运用MutMap v2.3.8软件包筛选并绘制InDel/SNP指数在水稻12条染色体上的滑动窗口分布图，结合遗传学原理，将发生SNP变异的SMG5候选基因定位于水稻第7条染色体上27.5~29.2 Mb内，根据基因信息最终将候选基因暂定为LOC_Os07g47950，该基因编码一个丝氨酸(Ser)/苏氨酸(Thr)蛋白激酶，其功能尚未被鉴定。

结合PCR测序结果可知，smg5突变体中LOC_Os07g47950基因发生的C-T单碱基变化导致苏氨酸—异亮氨酸变化，此突变恰好位于该基因所编码的Ser/Thr蛋白激酶结构域中。在籽粒大小调控OsMKKK10-OsMKK4-OsMAPK6级联反应途径中，OsMKK4激酶和OsMKKK10激酶也同样含有Ser/Thr蛋白激酶结构域。OsMKKK10可与OsMKK4相互作用并磷酸化OsMKK4，但MKKK10中Ser/Thr蛋白激酶结构域中的点突变会导致其对MKK4的磷酸化活性消失^[21]。另有研究表明Ser/Thr残基的保守性磷酸化通常对于MAPK活化十分关键，活化的MAPKKKs首先磷酸化MKKs的Ser/Thr残基，随后活化的MKKs对下游MAPKs保守结构域进行双重磷酸化，从而触发MAPKs对下游底物的活化^[33]。候选基因LOC_Os07g47950中单碱基突变所导致的氨基酸变化可能会改变其所编码的激酶活性，从而影响其对上下游激酶的磷酸化/去磷酸化过程，最终调控籽粒形态，但其具体的分子机制仍需后续试验进一步验证。综上，克隆SMG5基因，通过功能分析解析SMG5调控粒型的分子机制，对于完善水稻粒型调控网络具有重要意义。

3.2. 结论

本研究从籼稻保持系XD1B的EMS诱变库中鉴定到1个水稻小籽粒突变体smg5。与野生型相比，smg5突变体粒长、粒宽和千粒质量显著降低；植株整体紧凑且矮化，穗型直立，且二次枝梗数、每穗颖花数、每穗粒数和结实率均显著低于野生型。组织细胞学分析表明，SMG5基因通过正向调控颖壳纵向细胞增殖和横向细胞扩展，分别影响籽粒的长度和宽度。遗传分析表明，该突变体性状受1对隐性单基因控制。利用XD1B和smg5突变体构建F₂分离群体，采用MutMap方法将LOC_Os07g47950基因暂定为SMG5的候选基因。PCR测序显示，LOC_Os07g47950基因的第5个外显子的第37位发生了C-T单碱基替换，导致原本编码的氨基酸由苏氨酸变为了异亮氨酸。该突变位点恰好位于其所编码的Ser/Thr蛋白激酶结构域中。本研究进一步丰富了与籽粒形态相关的突变体材料，为深入理解水稻粒形调控网络提供了基因资源。

Figure (6) Table (2) Reference (33)

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Identification of Phenotype and Analysis of Candidate Gene of Rice Small Grain Mutant smg5